Summary
Dieser Artikel beschreibt, wie die elektrische Impedanzmyographie in vivo (unter Verwendung von Oberflächen- und Nadelelektrodenarrays) und ex vivo (unter Verwendung einer dielektrischen Zelle) am Musculus gastrocnemius von Nagetieren durchgeführt wird. Es wird die Technik sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten demonstrieren und die verfügbaren Modifikationen (z. B. fettleibige Tiere, Welpen) detailliert beschreiben.
Abstract
Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) ist eine praktische Technik, die in präklinischen und klinischen Studien verwendet werden kann, um die Gesundheit und Krankheit des Muskelgewebes zu beurteilen. EIM wird erhalten, indem ein richtungsfokussierter elektrischer Strom niedriger Intensität an einen Muskel von Interesse über einen Frequenzbereich (d. h. von 1 kHz bis 10 MHz) angelegt und die resultierenden Spannungen aufgezeichnet werden. Aus diesen werden mehrere Standardimpedanzkomponenten, einschließlich Reaktanz, Widerstand und Phase, erhalten. Bei Ex-vivo-Messungen an ausgeschnittenen Muskeln können auch die inhärenten passiven elektrischen Eigenschaften des Gewebes, nämlich die Leitfähigkeit und die relative Dielektrizitätskonstante, berechnet werden. EIM wurde ausgiebig bei Tieren und Menschen eingesetzt, um Muskelveränderungen bei einer Vielzahl von Krankheiten zu diagnostizieren und zu verfolgen, in Bezug auf einfache Nichtgebrauchsatrophie oder als Maßnahme der therapeutischen Intervention. Klinisch bietet EIM das Potenzial, das Fortschreiten der Krankheit im Laufe der Zeit zu verfolgen und die Wirkung therapeutischer Interventionen zu bewerten, wodurch die Möglichkeit besteht, die Dauer klinischer Studien zu verkürzen und die Anforderungen an die Stichprobengröße zu reduzieren. Da EIM sowohl in lebenden Tiermodellen als auch beim Menschen nichtinvasiv oder minimalinvasiv durchgeführt werden kann, bietet es das Potenzial, als neuartiges translationales Werkzeug zu dienen, das sowohl die präklinische als auch die klinische Entwicklung ermöglicht. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-EIM-Messungen an Mäusen und Ratten, einschließlich Ansätzen zur Anpassung der Techniken an bestimmte Bedingungen, z. B. zur Anwendung bei Welpen oder fettleibigen Tieren.
Introduction
Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) bietet eine leistungsstarke Methode zur Beurteilung des Muskelzustands, die möglicherweise die Diagnose neuromuskulärer Erkrankungen, die Verfolgung des Krankheitsverlaufs und die Beurteilung des Ansprechens auf Therapie 1,2,3 ermöglicht. Es kann analog auf Tierkrankheitsmodelle und Menschen angewendet werden, was eine relativ nahtlose Übertragung von präklinischen zu klinischen Studien ermöglicht. EIM-Messungen werden leicht mit vier linear angeordneten Elektroden durchgeführt, wobei die beiden äußeren einen schmerzlosen, schwachen elektrischen Strom über einen Frequenzbereich (im Allgemeinen zwischen 1 kHz und etwa 2 MHz) und die beiden inneren die resultierenden Spannungen aufzeichnen1. Aus diesen Spannungen können die Impedanzeigenschaften des Gewebes gewonnen werden, einschließlich des Widerstands (R), ein Maß dafür, wie schwierig es ist, Strom durch das Gewebe zu fließen, und die Reaktanz (X) oder "Aufladbarkeit" des Gewebes, ein Maß für die Fähigkeit des Gewebes, Ladung zu speichern (Kapazität). Aus der Reaktanz und dem Widerstand wird der Phasenwinkel (θ) über die folgende Gleichung berechnet: 
, was ein einzelnes summatives Impedanzmaß ergibt. Solche Messungen können mit jedem Multifrequenz-Bioimpedanzgerät durchgeführt werden. Da Myofasern im Wesentlichen lange Zylinder sind, ist Muskelgewebe auch stark anisotrop, wobei der Strom leichter entlang der Fasern fließt als über sie 4,5. Daher wird EIM oft in zwei Richtungen durchgeführt: mit dem Array, das entlang der Fasern so platziert ist, dass der Strom parallel zu ihnen fließt, und durch den Muskel, so dass der Strom senkrecht zu ihnen fließt. Zusätzlich können bei Ex-vivo-Messungen, bei denen ein bekanntes Gewebevolumen in einer Impedanzmesszelle gemessen wird, die inhärenten elektrischen Eigenschaften des Muskels (d. h. Leitfähigkeit und relative Permittivität) abgeleitet werden6.
Der Begriff "neuromuskuläre Erkrankungen" definiert ein breites Spektrum von primären und sekundären Erkrankungen, die zu strukturellen Muskelveränderungen und Funktionsstörungen führen. Dazu gehören amyotrophe Lateralsklerose und verschiedene Formen der Muskeldystrophie sowie einfachere Veränderungen im Zusammenhang mit dem Altern (z. B. Sarkopenie), Nichtgebrauchsatrophie (z. B. aufgrund längerer Bettruhe oder Schwerelosigkeit) oder sogar Verletzungen7. Während die Ursachen zahlreich sind und vom Motoneuron, Nerven, neuromuskulären Verbindungen oder dem Muskel selbst ausgehen können, kann EIM verwendet werden, um frühe Veränderungen im Muskel aufgrund vieler dieser Prozesse zu erkennen und das Fortschreiten oder Ansprechen auf die Therapie zu verfolgen. Bei Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) wurde beispielsweise gezeigt, dass EIM das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf Kortikosteroide erkennt8. Jüngste Arbeiten haben auch gezeigt, dass EIM empfindlich auf unterschiedliche Nichtnutzungszustände reagiert, einschließlich der fraktionierten Schwerkraft9, wie sie auf dem Mond oder Mars auftreten würde, und der Auswirkungen des Alterns10,11. Schließlich wird es durch die Anwendung von prädiktiven und maschinellen Lernalgorithmen auf den Datensatz, der mit jeder Messung erhalten wird (multifrequenz- und richtungsabhängige Daten), möglich, histologische Aspekte des Gewebes abzuleiten, einschließlich Myofasergröße 12,13, entzündliche Veränderungen und Ödeme14 sowie Bindegewebe und Fettgehalt 15,16.
Mehrere andere nichtinvasive oder minimalinvasive Methoden werden auch verwendet, um die Muskelgesundheit bei Menschen und Tieren zu bewerten, einschließlich der Nadelelektromyographie17 und bildgebender Verfahren wie Magnetresonanztomographie, Computertomographie und Ultraschall18,19. EIM zeigt jedoch deutliche Vorteile im Vergleich zu diesen Technologien. Zum Beispiel erfasst die Elektromyographie nur die aktiven elektrischen Eigenschaften der Myofasermembranen und nicht die passiven Eigenschaften und kann daher keine echte Beurteilung der Muskelzusammensetzung oder -struktur liefern. In gewisser Hinsicht sind bildgebende Verfahren enger mit EIM verwandt, da auch sie Aufschluss über die Struktur und Zusammensetzung von Gewebe geben. Aber in gewissem Sinne liefern sie zu viele Daten, die eine detaillierte Bildsegmentierung und Expertenanalyse erfordern, anstatt nur einen quantitativen Output zu liefern. Darüber hinaus werden bildgebende Verfahren aufgrund ihrer Komplexität auch stark von den Besonderheiten der verwendeten Hard- und Software beeinflusst, was im Idealfall die Verwendung identischer Systeme erfordert, damit Datensätze verglichen werden können. Im Gegensatz dazu bedeutet die Tatsache, dass EIM viel einfacher ist, dass es weniger von diesen technischen Problemen betroffen ist und keine Form von Bildverarbeitung oder Expertenanalyse erfordert.
Das folgende Protokoll zeigt, wie In-vivo-EIM bei Ratten und Mäusen durchgeführt wird, wobei sowohl nichtinvasive (Oberflächenarray) als auch minimalinvasive (subdermale Nadelarray) Techniken sowie ex vivo EIM an frisch herausgeschnittenen Muskeln angewendet werden.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Beth Israel Deaconess Medical Center unter den Protokollnummern (031-2019; 025-2019) genehmigt. Tragen Sie geeignete PSA-Ausrüstung für den Umgang mit Tieren und halten Sie sich an die IACUC-Richtlinien für alle Tierarbeiten.
1. In-vivo-Oberflächen-EIM
- Legen Sie das Tier in eine Anästhesiebox, um eine Anästhesie einzuleiten.
ANMERKUNG: Für Ratten wurden 1,5%-3,5% Isofluran und 2 O2L·min-1 und für Mäuse 2% Isofluran und 1O2L·min-1 verwendet. - Nach vollständiger Betäubung, wie durch das Ausbleiben der Reaktion nach dem Einklemmen des Fußes des Tieres angezeigt, legen Sie die Maus in Bauchlage auf die Bank und verwenden Sie den Nasenkegel, um die Anästhesie mit 1,5% Isofluran und einem Sauerstofffluss von 1 L·min-1 aufrechtzuerhalten.
- Platzieren Sie das zu analysierende Bein des Tieres in einem 45°-Winkel mit dem Hüftgelenk (Knie gestreckt) und sichern Sie den Fuß mit medizinischem Klebeband.
- Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um das Fell zu trimmen, das den Musculus gastrocnemius überlagert.
- Tragen Sie eine dicke Schicht Enthaarungscreme auf die Haut des Tieres auf und lassen Sie es 1 Minute einwirken. Verwenden Sie dann salzhaltige Gaze, um das Enthaarungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, bis das gesamte Fell, das den Musculus gastrocnemius überlagert, entfernt ist.
HINWEIS: Legen Sie ein mit Kochsalzlösung getränktes Mullkissen über die Haut, wenn keine Messungen durchgeführt werden, um eine Austrocknung der Haut zu verhindern. - Schließen Sie das Oberflächenarray (Abbildung 1) an das EIM-Gerät an, und lassen Sie die Elektroden auf einem in Kochsalzlösung getränkten Stück Gaze ruhen.
- Platzieren Sie die Oberflächenanordnung direkt auf der Haut über dem Musculus gastrocnemius, längs orientiert zu den Muskelfasern.
- Nach der Überprüfung des entsprechenden Kontakts, der durch alle grün erscheinenden Balken in der Software angezeigt wird, die die Stabilität der Widerstands-, Reaktanz- und Phasenwerte von 50 kHz anzeigen, erfassen Sie die EIM-Messungen.
HINWEIS: Kurven sollten in Echtzeit überprüft werden, um eine ordnungsgemäße Datenerfassung zu gewährleisten. - Drehen Sie die Oberflächenanordnung um 90° und positionieren Sie sie auf der Haut über dem Gastrocnemius neu, um die Quermaße zu erhalten (prüfen Sie auf grüne Balken, die die Stabilität anzeigen).
- Wiederholen Sie die Schritte 1.7, 1.8 und 1.9, um insgesamt vier Messungen pro Muskel zu erhalten: zwei Längs- und zwei Quermessungen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Enthaarungsmittel nicht mehr als einmal (d. h. bis zu drei Anwendungen in derselben Instanz) alle zwei Wochen, um übermäßige Hautreizungen und Verletzungen zu vermeiden. Es ist wichtig, die Messungen innerhalb von etwa 5-10 Minuten nach dem Entfernen der Enthaarungscreme durchzuführen, da die Entwicklung von lokalisierten Hautödemen, die durch das Enthaarungsmittel induziert werden, die gesammelten Impedanzdaten beeinflussen kann. Die Erholung des Tieres erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Isofluran-Anästhesie und das Verfahren erfordert keine analgetische Behandlung.
2. In-vivo-Nadelarray-EIM
- Betäuben Sie das Tier und bereiten Sie das Bein nach dem gleichen Verfahren vor wie in den Schritten 1.1-1.4 beschrieben. Es ist jedoch nicht notwendig, ein Enthaarungsmittel zu verwenden, wenn in vivo EIM mit einem Nadelarray durchgeführt wird.
- Schließen Sie das Nadelfeld (Abbildung 2A-F) an das EIM-Gerät an und lassen Sie es in einem Wiegeboot ruhen, das Kochsalzlösung enthält. Überprüfen Sie die Konnektivität und Signalstabilität (gekennzeichnet durch grüne Balken).
- Desinfizieren Sie Haut und Nadeln mit Alkohol. Platzieren Sie die Nadelanordnung in einer Längsposition im Vergleich zu den Myofasern und drücken Sie sie fest in die Haut, bis alle Nadeln die Haut und den darunter liegenden Muskel bis zum Kunststoffschutz auf dem Array durchdringen. Erfassen von Daten.
- Entfernen Sie das Array vorsichtig und führen Sie es in einem 90°-Winkel relativ zur ersten Messung in Querrichtung durch die Haut und wieder in den Muskel ein. Erfassen von Daten.
HINWEIS: Bei Verwendung von Nadelarrays sollten Messungen nur einmal in jede Richtung durchgeführt werden, um den Einfluss der Nadelelektroden auf Haut und Muskelgewebe zu reduzieren. Wenn Blutungen auftreten, wischen Sie das Blut vorsichtig ab, bevor Sie die zweite Messung durchführen. Die Erholung des Tieres erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Isofluran-Anästhesie und das Verfahren erfordert keine analgetische Behandlung.
3. Ex-vivo-EIM
- Bereiten Sie die Ex-vivo-dielektrische Zelle vor (Abbildung 2G,H), geben Sie Kochsalzlösung in die Kammer und verbinden Sie die Zelle mit dem EIM-Gerät, um die Referenzwerte zu erhalten.
HINWEIS: Die Phasen- und Reaktanzwerte der Kochsalzlösung sollten konstant bei oder nahe Null bleiben und die Widerstandswerte der Kochsalzlösung sollten bei etwa 100 ± 25 Ω über den Frequenzbereich von 1 kHz bis 1 MHz konstant bleiben. - Euthanasieren Sie das Tier gemäß den jeweiligen IACUC-Richtlinien.
- Schneiden Sie mit einer Schere die Haut in der Nähe der Achillessehne ab. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben, um die darunter liegenden Muskeln und Faszien freizulegen. Sezieren Sie vorsichtig den Bizeps femoris, der den Musculus gastrocnemius überlagert und den Ischiasnerv schneidet.
- Schneiden Sie die Achillessehne ab, um das distale Ende der Muskeln Gastrocnemius und Soleus zu befreien, und ziehen Sie die Sehne vorsichtig nach oben, während Sie mit einer Schere alle Anhänge entfernen. Sobald alle Aufsätze entfernt sind, schneiden Sie mit einer Schere das rostrale Ende des Soleusmuskels ab und entfernen Sie es.
- Verwenden Sie eine Schere, um die Köpfe des Musculus gastrocnemius um die Patella herum zu sezieren.
HINWEIS: Nach der Entfernung des Musculus gastrocnemius ist es wichtig, sich an die ursprüngliche Ausrichtung der Myofasern zu erinnern. - Legen Sie den Gastrocnemius-Muskel auf eine Zahnwachsschicht und schneiden Sie ihn mit einer Rasierklinge und einem Lineal, um einen 10 mm x 10 mm großen Abschnitt von der Mitte des Musculus gastrocnemius zu erhalten.
HINWEIS: Die dielektrische Zellengröße kann angepasst werden. Für Ratten wurde eine 10 mm x 10 mm Zelle und für Mäuse eine 5 mm x 5 mm Zelle verwendet. - Legen Sie den Gastrocnemius vorsichtig mit einer Pinzette in die dielektrischen Zellen und stellen Sie sicher, dass die Fasern längs ausgerichtet sind (d. H. Schwanz- und Rostralextremitäten sollten die Elektroden berühren). Stellen Sie sicher, dass der Muskel vollständig mit den Metallelektroden in Kontakt steht.
- Befestigen Sie den oberen Teil der dielektrischen Zelle und führen Sie zwei Monopolnadeln (26 G) in die beiden Löcher ein. Verbinden Sie die Drähte des EIM-Geräts mit der Ex-vivo-Zelle in der folgenden Reihenfolge: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, wobei I für die Stromelektroden und V für die Spannungselektroden steht). Erfassen Sie die Längsschnittmessung.
- Öffnen Sie die dielektrische Zelle und richten Sie den Muskel in Querrichtung neu aus, indem Sie ihn um 90° drehen. Befestigen Sie die Oberseite der dielektrischen Zelle wieder. Erfassen Sie die Quermessung.
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Representative Results
EIM kann unter vielen Bedingungen erhalten werden, einschließlich Oberflächen-in-vivo-Arrays (Abbildung 1), Nadel-in-vivo-Arrays (Abbildung 2A-F) und Ex-vivo-dielektrischen Zellen (Abbildung 2G, H).
EIM liefert eine nahezu augenblickliche Momentaufnahme des Muskelzustands basierend auf den gemessenen Impedanzwerten. Die Messungen werden schnell erfasst und führen zu einer einfachen Ausgabedatendatei, die keine spezielle Software erfordert (Abbildung 3A). Tatsächlich wird jedes Multifrequenz-Impedanzgerät, das Daten für einzelne Frequenzen liefert, in der Lage sein, einen Standard-.csv-Ausgang zu erzeugen, der unabhängig geöffnet werden kann. Das in diesem Protokoll beschriebene System liefert auch den Namen und die Bedingungen des Experiments mit Werten für Phase, Reaktanz und Widerstand für jeden Versuch bei jeder gemessenen Frequenz in der Ausgabedatei. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, werden in der Regel zwei Versuche mit longitudinalen (Versuche 1 und 3) und transversalen (Versuche 2 und 4) Werten ermittelt und gemittelt und für alle nachfolgenden Analysen verwendet.
Wenn EIM-Werte als Funktion der Frequenz angezeigt werden, ergeben sie Standardkurven, die analysiert werden können, um falsche oder mit Artefakten kontaminierte Daten zu erkennen. Solche Unregelmäßigkeiten hängen in der Regel mit Kontaktproblemen bei Oberflächenmessungen zusammen, was zu Extremwerten führt, die bei niedrigen Frequenzen beobachtet werden (typischerweise große positive oder negative Werte). Repräsentative Kurven werden für Phase (Abbildung 3B), Reaktanz (Abbildung 3C) und Widerstand (Abbildung 3D) für longitudinale (blaue Kreise) und transversale (graue Quadrate) Messungen angezeigt. Ein Diagramm, das die Reaktanz als Funktion des Widerstands (Cole-Cole-Diagramm) sowohl in Längs- als auch in Querrichtung zeigt, wird ebenfalls angezeigt (Abbildung 3E). Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da er Teil der Datenprüfung ist und die einfache Erkennung von falschen oder mit Artefakten kontaminierten Daten ermöglicht. Wenn ein übermäßiges Artefakt (normalerweise aufgrund eines schlechten Kontakts zwischen dem Oberflächenarray und der Haut) festgestellt wird, können mehrere Verfahren zur Verbesserung des Kontakts durchgeführt werden. Dazu gehören das Auftragen einer zusätzlichen Anwendung von Enthaarungscreme, das Befeuchten der Haut für ca. 1 min mit einem salzhaltigen Gazepad oder das sanfte Ausüben von Druck auf das Elektrodenarray. Im Allgemeinen hilft auch der einfache Prozess, die Messung mehrmals zu wiederholen, um dieses Problem zu lösen.
EIM-Messungen spiegeln die Reaktion des Muskelgewebes auf elektrischen Strom über einen breiten Frequenzbereich wider, die jeweils auf unterschiedliche Strukturen abzielen. Zum Beispiel durchdringen niedrige Frequenzen (d. h. 5 kHz) die Myofasermembran nicht, was eine Analyse der extrazellulären Merkmale ermöglicht, die zum Nachweis von Entzündungen und neutrophiler Infiltration verwendet werden können14. Im Gegensatz dazu können hohe Frequenzen (>1 MHz) Zellmembranen durchdringen und somit sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Räume abfragen und wurden zur Differenzierung von Muskelfasern Typ1 verwendet.
Abbildung 1: 3D-gedrucktes Oberflächenarray. Fotos eines Oberflächenarrays, das in 3D gedruckt wurde, um Oberflächenimpedanzmessungen (sowohl longitudinal als auch transversal) in Mäusen in vivo zu erhalten. (A) Eine Fotografie, die das an die Aufnahmevorrichtung angeschlossene Oberflächenarray zeigt. (B) Eine Nahaufnahme der Oberflächenanordnung, die das Rad zeigt, mit dem das Array um 90° gedreht wird, um sowohl Längs- als auch Quermessungen zu erhalten. (C) Nahaufnahme der Oberflächenelektroden. Die Oberflächenelektroden haben folgende Eigenschaften: Elektrodenbreite = 0,5 mm, Länge der Außenelektroden = 4 mm, Länge der Innenelektroden = 3 mm und Abstand zwischen den Elektroden = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Andere Arrays, die für bestimmte experimentelle Designs verwendet werden können. Fotos von: (A) einer Nadelanordnung für Ratten, die beschichtet (mit nichtmetallischem Nagellack) beschichtet ist, um den Beitrag von subkutanem Fett zu verringern (2 mm Raum, 4 mm tief, 2 mm Beschichtung); b) eine Nadelanordnung mit einem Abstand von 2 mm und einer Tiefe von 4 mm; c) eine Nadelanordnung mit einem Abstand von 2 mm und einer Tiefe von 3 mm; d) eine Nadelanordnung mit einem Abstand von 2 mm und einer Tiefe von 2 mm; (E) eine Nadelanordnung für kleinere Tiere und Jungtiere mit einem Abstand von 1 mm und einer Tiefe von 2 mm; f) eine Nadelanordnung mit einem Abstand von 1 mm und einer Tiefe von 1 mm; g) eine auf adulte Mausmuskeln zugeschnittene Ex-vivo-dielektrische Zelle (5 mm x 5 mm); und (H) eine auf Rattenmuskeln zugeschnittene Ex-vivo-dielektrische Zelle (10 mm x 10 mm). Modifikationen (Ergebnisse, die hier nicht dargestellt werden) zur Erfassung von Messungen an adipösen Tieren (d. h. ob / ob oder db / db-Mäusen) können durch Vergrößern der Nadellänge, Hinzufügen einer nichtleitenden Beschichtung und Vergrößern / Verringern des Nadelabstands durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Datenausgabe und repräsentative Kurven bei Mäusen mit In-vivo-Oberflächen-EIM in longitudinaler (blau) und transversaler (grauer) Richtung. (A) Ausgabedatei in .csv Format, erhalten nach der Erfassung von zwei Längs- (Messungen 1 und 3, blau eingefärbt) und zwei transversalen (Messungen 2 und 4, grau gefärbt) EIM-Messungen in vivo . Die Werte werden für jede Frequenz angegeben (Spalte A). Die Analysen werden anschließend anhand des Mittelwerts der Längs- bzw. Quermessungen durchgeführt. Die in den Zellen A1:B4 gefundenen Informationen werden automatisch von der Software entsprechend den während der EIM-Erfassung ausgewählten Beschriftungen ausgefüllt. Repräsentative Kurven sowohl für Längs- (blaue Kreise) als auch für transversale (graue Quadrate) Werte von Phase (B), Reaktanz (C) und Widerstand (D) als Funktion der Frequenz. In Übereinstimmung mit den üblichen Praktiken im Impedanzbereich wird die x-Achse mit einer logarithmischen Skala angezeigt. (E) Repräsentative Reaktanzkurven als Funktion des Widerstands sowohl für Längs- als auch für Quermessungen. LP: Längsphase; TP: Querphase; LX: longitudinale Reaktanz; TX: transversale Reaktanz; LR: Längswiderstand; und TR: Querwiderstand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Artikel werden die grundlegenden Methoden zur Durchführung von EIM bei Nagetieren sowohl in vivo als auch ex vivo beschrieben. Um zuverlässige Messungen zu erhalten, ist es wichtig, eine Reihe von Schritten durchzuführen. Zuerst muss man den Muskel von Interesse richtig identifizieren, da jeder Muskel unterschiedliche Reaktionen auf Krankheiten, Behandlung und Pathologie hat. Man muss bedenken, dass die Daten, die über einen Muskel (z. B. Gastrocnemius) erfasst wurden, nicht die gleichen Informationen liefern wie über einen anderen Muskel (z. B. Tibialis anterior). Zweitens muss man sorgfältig das beste Elektrodenarray auswählen, um die Impedanzmessungen durchzuführen. Während jeder Array-Typ sowohl Vor- als auch Nachteile hat, ist es wichtig, ein Array zu wählen, das zum experimentellen Design passt und gleichzeitig den Krankheitsverlauf und die Auswirkungen auf die Anatomie (z. B. schwere Atrophie) berücksichtigt. Schließlich ermöglicht EIM den Ermittlern, eine unglaubliche Menge an Daten in wenigen Sekunden zu sammeln, aber die Qualitätskontrolle muss ordnungsgemäß durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine Artefakte vorhanden sind.
Das EIM-System ist auf mehreren Ebenen hochgradig anpassbar. Während das hier eingesetzte System für die klinische und präklinische Datenerhebung konzipiert wurde, kann hierfür jedes Multifrequenz-Impedanzmesssystem eingesetzt werden, sofern es individuelle Frequenzdaten liefert. Im Allgemeinen bieten Impedanzsysteme eine Standard-.csv-Datei als Ausgabe. Ebenso können zusätzliche Änderungen an den Arrays vorgenommen werden, da alles, was wirklich benötigt wird, vier Elektroden sind, die in einer Linie platziert sind. Zum Beispiel wurde in diesem Protokoll eine Vielzahl von maßgeschneiderten Elektroden verwendet, um die Anforderungen zu erfüllen, aber Arrays können mit einfachen (z. B. Epoxidkleber, subdermalen Nadeln) oder komplexen (z. B. 3D-Drucker) Werkzeugen an individuelle Bedürfnisse angepasst werden. Alternativ können die vier Elektroden zu einer einzigen Nadel kombiniert werden, wie zuvor beschrieben20. In unserem Labor wurden Arrays für Welpen entwickelt, indem der Abstand zwischen den Elektroden verringert wurde, um sicherzustellen, dass kleine Muskeln sowohl in Längs- als auch in Querrichtung gemessen werden können. Bei der Arbeit mit adipösen Tieren, die eine deutlich größere Schicht an subkutanem Fett aufweisen, wird die Verwendung von teilweise beschichteten Nadelelektroden empfohlen. Dies ermöglicht einen größeren Beitrag des Muskelgewebes zur Impedanzmessung bei gleichzeitiger Verringerung des Beitrags des Fettgewebes21.
Während Nadelmethoden und Oberflächenmethoden sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen angewendet werden können, wie beschrieben und demonstriert, wird allgemein empfohlen, die Nadelmessungen bei Ratten zu verwenden, da diese schneller sind, da sie keinen Aufwand zur Vorbereitung der Haut erfordern. Darüber hinaus bedeutet ihre größere Größe, dass die Nadelelektroden den Muskel nur minimal verletzen. Bei Mäusen werden aufgrund ihrer geringen Größe Oberflächenmessungen empfohlen, um Muskelverletzungen zu vermeiden und da die Hautvorbereitung relativ einfach und schnell ist.
Jede EIM-Technik hat ihre eigenen Einschränkungen. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass Elektrodenarrays nicht ohne weiteres über Anbieter erhältlich sind und stattdessen eine kundenspezifische Generierung im Labor erfordern. Um neue Forscher zu unterstützen, enthält dieses Protokoll Messungen für mehrere Arrays (sowohl handgefertigt als auch 3D-gedruckt), und die Autoren werden benutzerdefinierte Arrays bereitstellen oder die zugehörigen CAD-Dateien auf Anfrage zur Verfügung stellen. Wie bereits erwähnt, ist die Datenqualität von entscheidender Bedeutung, und zusätzliche Probleme können die Datenqualität für jeden der Messtypen (z. B. Oberfläche, Nadel und ex vivo) beeinträchtigen. Für gute Oberflächendaten ist es notwendig, das Haar und wahrscheinlich auch das Stratum corneum der Haut vollständig zu entfernen, um die besten Ergebnisse mit minimalem Kontaktartefakt zu erzielen. Die Verwendung des Enthaarungsmittels bedeutet jedoch auch, dass die Haut im Laufe der Zeit langsam ödematös wird, so dass es notwendig ist, die Impedanzmessungen nach der Haarentfernung schnell abzuschließen. Eine Wartezeit von 10 Minuten oder länger kann zu signifikant anderen Werten führen als bei der Durchführung der Messungen innerhalb von ein oder zwei Minuten nach der Haarentfernung. Nadelarray-Messungen bei Ratten oder Mäusen induzieren typischerweise mindestens eine kleine Menge an Blutungen, die sich auf die Messwerte auswirken könnten, wenn es sich in ein größeres Hämatom um die eingeführten Nadeln verwandelt. Schließlich erfordern Ex-vivo-Messungen besondere Sorgfalt, um sicherzustellen, dass die Muskelfasern innerhalb der dielektrischen Zelle in Bezug auf die Metallplatten genau ausgerichtet sind. Schließlich kann es bei kleinen oder kranken Mäusen aufgrund der geringen Größe der Muskeln unmöglich sein, transversale Messungen zu erhalten. Wie oben erwähnt, bleibt es jedoch möglich, kundenspezifische 4-Elektroden-Arrays zu entwickeln, die klein genug sein könnten, um longitudinale Messungen selbst in kleinsten Muskeln durchzuführen.
Die Datenanalyse kann recht einfach gehalten werden - zum Beispiel durch Messung eines einzelnen Ausgangs (z. B. Phase) bei einer einzigen Frequenz (z. B. 50 kHz) in einer einzigen Richtung (z. B. longitudinal) - oder ziemlich komplex, indem alle Impedanzparameter über das gesamte Frequenzspektrum sowohl in Längs- als auch in Querrichtung einbezogen werden. Wenn Einzelfrequenz-Impedanzwerte verwendet werden, liegen sie typischerweise im Bereich von 30-100 kHz, da der Muskel in diesem Frequenzbereich am reaktivsten (dh am "aufladbarsten") ist. Es wurden jedoch auch kondensierte oder kollabierte Parameter verwendet, die versuchen, die Form des Frequenzspektrums zu erfassen. Diese Werte umfassten Steigungen linearer Anpassungen der Widerstands-, Reaktanz- und Phasendaten22 und 2-Frequenzverhältnisse23. Alternativ können Cole-Cole-Parameter aus Anpassungen der Impedanzdaten berechnet werden, einschließlich R0 (Bestimmung des Widerstands bei Nullfrequenz), Rinf (Bestimmung des Widerstands bei unendlicher Frequenz) und fc (Mittenfrequenz) 24,25,26,27. Schließlich kann maschinelles Lernen verwendet werden, um alle Daten auf einmal zu analysieren und Vorhersagemodelle sowohl für die Regression 12,13,15,16 als auch für die Klassifizierung zu verbessern.
Trotz dieser Einschränkungen ist EIM ein leistungsfähiges und relativ einfaches Werkzeug, um mehrere Aspekte der Muskelgesundheit zu beurteilen. Während der Schwerpunkt dieses Manuskripts auf einem einzelnen Muskel (Gastrocnemius) liegt, steht der Anwendung von EIM bei anderen oberflächlichen Muskeln (z. B. Quadrizeps oder Bizeps brachii) mit Oberflächenelektroden oder tieferen Muskeln mit dem Nadelelektrodenarray nichts entgegen. Tatsächlich wurde die Technik beim Menschen in einer Vielzahl von Muskeln angewendet, darunter sowohl die oberen als auch die unteren Extremitäten8,28 sowie axiale Muskeln (z. B. paraspinale Muskeln und Bauchmuskeln)29,30.
Es hat sich gezeigt, dass EIM zuverlässige Maßnahmen in Bezug auf Krankheitsprogression, Remission der Atrophie und Behandlung im Laufe der Zeit bietet. Einzelhäufigkeitsdaten können völlig ausreichend sein, um den Krankheitsstatus im Zeitverlauf zu beurteilen31; Der Wert von Multifrequenzdaten besteht jedoch darin, dass sie immer noch helfen können, die Qualität der Messung zu beurteilen, wie oben beschrieben. Einfrequenzdaten könnten isoliert durch Kontaktartefakte erheblich kontaminiert sein, und dies wäre nicht ersichtlich, ohne das gesamte Impedanzspektrum zu überprüfen. In klinischen Studien kann Oberflächen-EIM häufig verwendet werden, um schmerzlose Messungen zu erhalten, was es zu einem einfachen Werkzeug für die Anwendung macht32. Diese Fülle an Daten kann entscheidend sein, um das Fortschreiten der Krankheit empfindlicher zu verfolgen. Darüber hinaus kann die Aufnahme von EIM in klinische Protokolle die Anzahl der während einer klinischen Studie erforderlichen Teilnehmer erheblich reduzieren28,31.
EIM findet zunehmend Anwendung bei der Beurteilung einer Vielzahl von neuromuskulären Erkrankungen beim Menschen. Dementsprechend trägt die Fähigkeit, die Technik effektiv bei Nagetieren durchzuführen, dazu bei, den potenziellen praktischen Wert der Technologie zu erweitern und gleichzeitig unser Verständnis der Beziehung zwischen verschiedenen EIM-Ergebnissen und der zugrunde liegenden Histologie zu verbessern. Die Technik ist im Allgemeinen einfach zu bedienen und verdient es zusammen mit den nützlichen quantitativen Daten, die sie liefert, in das Standardarsenal von Werkzeugen zur Beurteilung von Nerven- und Muskelerkrankungen in Nagetierkrankheitsmodellen aufgenommen zu werden.
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Disclosures
S. B. Rutkove ist an Myolex, Inc., einem Unternehmen, das Impedanzgeräte für klinische und Forschungszwecke entwickelt, und dem hier verwendeten mView-System beteiligt und fungiert als Berater und wissenschaftlicher Berater. Er ist auch Mitglied des Board of Directors des Unternehmens. Das Unternehmen hat auch eine Option zur Lizenzierung der patentierten Impedanztechnologie, deren Erfinder S. B. Rutkove genannt wird. Die anderen Autoren haben keine anderen relevanten Verbindungen oder finanzielle Beteiligung an einer Organisation oder Entität mit einem finanziellen Interesse an oder einem finanziellen Konflikt mit dem Gegenstand oder den Materialien, die im Manuskript besprochen werden, abgesehen von den offengelegten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Charley's Fund und NIH R01NS055099 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
- Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
- Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
- Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
- Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
- Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
- Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
- Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
- Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
- Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
- Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
- Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
- Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
- Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
- Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
- Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
- Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
- Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
- Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
- Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
- Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
- Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
- Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
- Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
- Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
- Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
- Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
- Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
- Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
- Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
- Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
- Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
- Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).
