Summary
このプロトコルは、例としてp53腫瘍抑制タンパク質を使用して哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な方法を記載している。ユビキチン化p53タンパク質を、ストリンジェントな非変性および変性条件下で細胞から精製した。
Abstract
ユビキチン化は、基質タンパク質の安定性だけでなく局在や機能も調節する翻訳後修飾の一種です。ユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、ほとんどすべての基本的な細胞生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化タンパク質の精製は、基質タンパク質の機能制御におけるユビキチン化の役割の研究に役立ちます。ここでは、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な手順を、p53腫瘍抑制タンパク質を例に説明する。ユビキチン化p53タンパク質は、ストリンジェントな非変性および変性条件下で精製した。全細胞Flagタグ付きp53タンパク質を、非変性条件下で抗Flag抗体結合アガロースで精製しました。あるいは、全細胞Hisタグユビキチン化タンパク質を、変性条件下でニッケル荷電樹脂を用いて精製した。溶出液中のユビキチン化p53タンパク質は、特異的抗体で検出することに成功しました。この手順を使用すると、特定のタンパク質のユビキチン化形態を哺乳類細胞から効率的に精製することができ、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割に関する研究が容易になります。
Introduction
ユビキチンは、76個のアミノ酸1,2,3の進化的に保存されたタンパク質です。ユビキチンは、活性化(E1)、結合(E2)、およびリガーゼ(E3)酵素を含むカスケードを介して、標的タンパク質上のリジン残基に共有結合します。ユビキチンは最初にE1酵素によって活性化され、次にE2結合酵素に移されます。続いて、E3ユビキチンリガーゼは、ユビキチン負荷E2酵素および基質タンパク質の両方と相互作用し、ユビキチンのC末端と基質1,2,3,4,5中のリジン残基との間のイソペプチド結合の形成を媒介する。ユビキチン化は、ユビキチン部分の基質タンパク質上のリジン残基またはそれ自体への結合を含み、タンパク質モノユビキチン化またはポリユビキチン化をもたらす。このユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、多種多様な生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化は、ユビキチン・プロテアソーム系を介して基質タンパク質の分解をもたらす1,2,3,4,5。さらに、ユビキチン化は、細胞におけるタンパク質細胞内局在、タンパク質複合体形成、およびタンパク質輸送を調節する3,5。基質タンパク質にライゲーションされたユビキチン部分は、脱ユビキチン化酵素(DUB)によって除去することができる6,7。特に、ユビキチン鎖が組み立てられるさまざまな方法は、さまざまな生物学的プロセスを調節するための無数の手段を提供します1,5。基質タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の正確な役割は、これまで完全には理解されていません。ユビキチン化タンパク質の精製は、タンパク質ユビキチン化が様々な細胞プロセスに及ぼす影響の解明に貢献します。
p53タンパク質は最も重要な腫瘍抑制タンパク質の1つであり、ほとんどすべてのヒト癌において遺伝子変異または不活性化を示す8,9,10,11。p53の安定性と活性は、ユビキチン化、リン酸化、アセチル化、メチル化などの翻訳後修飾によってin vivoで微妙に調節されています12,13。p53タンパク質は、様々な細胞において6分から40分の範囲の短い半減期を有し、これは主にそのポリユビキチン化およびその後のプロテアソーム分解に起因する10,12。マウスダブルミニッツ2(Mdm2)は、p53のE3ユビキチンリガーゼであり、p53のN末端に結合してその転写活性を阻害する12、14、15。Mdm2は、p53のポリユビキチン化とプロテアソーム分解を促進してその安定性を制御し、p53のモノユビキチン化を誘導して核輸送を促進します12,14,15,16。ここでは、Mdm2を介したp53ユビキチン化を例に、哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製する方法を詳細に紹介する。標的タンパク質のユビキチン化状態に影響を与える調節因子は、哺乳類細胞で過剰発現またはノックダウン/ノックアウトされた場合に、このin vivoユビキチン化アッセイを使用して同定できます。さらに、ユビキチン化タンパク質は、in vitroデユビキチン化アッセイの基質として使用できます。ハイスループットスクリーニングを実行して、ユビキチン化基質を個々のDUBとインキュベートすることにより、標的タンパク質の特定のDUBを同定できます。ユビキチン化タンパク質は、細胞内の下流のシグナル伝達タンパク質を動員するための足場として機能する可能性があります。ユビキチン化された標的タンパク質複合体は、天然の精製条件下での逐次免疫沈降によって精製し、質量分析によって同定することができる。現在のプロトコルは、ユビキチン化によって調節される細胞タンパク質を調査するために広く使用することができる。
ユビキチン化タンパク質を精製するには、アフィニティータグ付きユビキチン、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、単離されたユビキチン結合ドメイン(UBD)の使用など、いくつかの方法が確立されています17。ここでは、アフィニティタグ付きユビキチンをメディエーターとして使用して、哺乳類細胞内のユビキチン化タンパク質を精製するプロトコルを提供します。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、他の方法よりも優れています。ユビキチン化タンパク質は、強力な変性剤の存在下で精製され、細胞タンパク質を線形化し、タンパク質間相互作用を破壊することにより、ニッケル荷電樹脂への非特異的結合を低減します。対照的に、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、および単離されたUBDをメディエーターとして使用すると、精製はそれほど厳しくない条件下で行う必要があるため、結合パートナーを標的タンパク質から効果的に排除することはできません。さらに、精製は、これらのメディエーターを使用した無関係タンパク質の結合の増加にもつながる可能性があります。さらに、様々なユビキチン結合型ならびにユビキチン結合タンパク質または単離されたUBDによるモノおよびポリユビキチン化に対する結合傾向がある17。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、すべての細胞ユビキチン化タンパク質を引き下げることに寄与する。あるいは、市販の抗Flagまたは抗HA抗体結合アガロースを使用することで、非変性条件下で大規模なFlagまたはHAタグ付き標的タンパク質の免疫沈降が容易になります。第2の精製工程は、例えば、ポリHisタグ付きユビキチンを標的とするニッケル荷電樹脂によって、ダウンストリーム実験のために高純度でユビキチン化標的タンパク質を取得するために使用することができる。特に、エピトープタグ付け精製戦略は、特異的抗体を取得できない場合に、標的タンパク質を効果的に免疫沈降させることができます。最後に、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、インビ トロでの精製と比較して、より生理学的条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。
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Protocol
注:H1299細胞は、中国科学院の幹細胞バンクから親切に提供され、マイコプラズマ汚染に対して陰性であることが証明されました。
1. 細胞培養
- 最初の培養では、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%グルタミン添加剤、1%ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を添加した10-12 mLのRPMI 1640培地を入れた10 cmペトリ皿に、ヒト肺腺癌細胞株H1299の1 x 106 細胞を入れます。細胞を5%CO2を含む加湿インキュベーター内で37°Cに維持する。細胞が2%〜3%のコンフルエントに達したときに応じて、90〜90日ごとに細胞を分割します。
- トランスフェクションの1日前に、3つのペトリ皿用に6-9 x 10 6細胞を準備し、10-12 mLの培地を含む単一の10 cmペトリ皿に2-3 x 106細胞をプレートして、トランスフェクション中に70%-90%のコンフルエンスを達成します。
注:HEK293T細胞は、トランスフェクション効率が高く、タンパク質発現レベルが高いため、ユビキチン化タンパク質の精製にも使用できます。
2. プラスミドトランスフェクション
- 3本の15 mL遠沈管に1.5 mLの還元血清培地を加えます。
- トランスフェクション可能なプラスミドDNAを各チューブに加え、以下のように希釈します。チューブ1:1μgのFlag-p53プラスミド、12μgの空のベクター;チューブ2:1 μgのFlag-p53プラスミド、3 μgのHis-HA-Ub(HH-Ub)プラスミド、および9 μgの空のベクター。チューブ3:1 μgのFlag-p53プラスミド、3 μgのHH-Ubプラスミド、および9 μgのMdm2プラスミド。合計0.2 μgの緑色蛍光タンパク質(GFP)プラスミドを各チューブに追加して、トランスフェクション効率をモニタリングします。
注:細胞内で効率的な標的タンパク質発現を達成するために必要なプラスミドの最適量を決定するために、パイロット実験を実施する必要があります。 - 78 μLのリポソームトランスフェクション試薬を別の遠沈管内の4.5 mLの還元血清培地に加え、リポソームを希釈します。チューブをフリックして完全に混合し、室温(RT)で5分間放置します。
- 1.5 mLの希釈DNA溶液を含むステップ2.2から、1.5 mLの希釈リポソーム溶液を各チューブに追加します。プラスミドをリポソームと完全に混合し、RTで少なくとも20分間架橋します。 各トランスフェクションにプラスミドDNA:リポソーム比1:2(μg:μL)を使用します。
- ペトリ皿から元の培地を廃棄し、9 mLの還元血清培地を各皿に加えます。各ディッシュに3 mLのリポソーム-DNA混合物を加え、プレートを前後に3倍、次に左右に3倍に穏やかに振って溶液を混合し、プレート内の混合物を均等に分配します。
- 細胞を加湿インキュベーター内で5%CO2と共に37°Cで培養する。4〜6時間後に培地を交換し、24〜36時間細胞を培養し続けます。
3.細胞採取
- 24〜36時間後、細胞をMG132で最終濃度10μMで4〜6時間処理します。
注:MG132は、26Sプロテアソーム複合体のタンパク質分解活性を効率的にブロックするペプチドアルデヒドです。リジン-48(K48)結合ポリユビキチン鎖でユビキチン化されたタンパク質の量は、細胞をMG132または他のプロテアソーム阻害剤で処理した後に増やすことができます。 - 培地を廃棄し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回洗浄し(細胞を洗い流さないように注意)、血清学的ピペットで細胞を吸引します。
- 1 mLのPBSをディッシュに加え、きれいなスクレーパーでこすって細胞を取り除き、細胞懸濁液を微量遠心チューブに移します。700 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを収集します。
4. ユビキチン化タンパク質の非変性条件下での精製
- 使用前に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを新たに補充したフラグ溶解バッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.9)、137 mM NaCl、10 mM NaF、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1% Triton X-100、0.2% サルコシル、および10% グリセロール)を準備します。
- 800 μLの氷冷フラッグ溶解バッファーを各チューブの細胞に加え、ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、ローテーター上で4°Cで30分間インキュベートします。
- 超音波の5-10短いパルスに混合物をさらす。20 kHZの超音波処理周波数と80%の振幅で氷上で超音波処理を実行し、各パルスは1秒間持続します。混合物をローテーター上で毎分40回転(rpm)で4°Cで30分間インキュベートします。
- 超音波処理されたサンプルを8,000 x g で4°Cで20〜30分間遠心分離します。 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 細胞抽出液80 μL(1/10)を分注し、20 μLの5xドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ローディングバッファーと混合します。サンプルを98°Cで5分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、使用するまで-20°Cで保存します。これらのサンプルを入力グループとして使用して、タンパク質発現をモニターします。
- 残りの細胞抽出液に30 μLの抗Flag M2抗体結合(Flag/M2)ビーズを加え、ローテーター上で4°Cで少なくとも4時間または一晩インキュベートします。
- 1,500 x g で4°Cで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。1 mLの氷冷フラッグ溶解バッファーをビーズに加え、チューブを数回反転させて混合します。
- 1,500 x g で4°Cで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。手順4.7を4〜6回繰り返します。
- 最終濃度200 ng/μLのFlagペプチド40 μLをビーズに加え、ローテーター上で4°Cで2時間インキュベートして、結合したタンパク質を溶出します。
- 1,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 10 μLの5x SDSローディングバッファーを加え、混合物を98°Cで5分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、ウェスタンブロッティング用に-20°Cで保存します。あるいは、ステップ4.10の溶出液を、他の下流実験のために-80°Cで直接保存します。
注:精製されたユビキチン化タンパク質の量は、トランスフェクトされる細胞数とプラスミドの量を増やすことでスケールアップできます。エピトープタグ付け戦略は、天然の精製条件下でユビキチン化p53に特異的に結合する細胞複合体を精製するために適応させることができる。Flag-p53、mdm2、およびHA-ユビキチンを共発現させることにより、ユビキチン化p53タンパク質複合体を、哺乳類細胞からのシーケンシャルFlagおよびHA抗体結合アガロースによって免疫沈降することができる。ユビキチン化p53タンパク質の結合パートナーを維持するには、精製プロセス中に、より厳密でないBC100溶解バッファー(20 mM Tris-HCl(pH 7.9)、100 mM NaCl、10% グリセロール、0.2 mM EDTA、0.2% Triton X-100、および1xプロテアーゼ阻害剤)を使用する必要があります。HAペプチドからの溶出液を質量分析にかけ、ユビキチン化されたp53に特異的に結合するすべてのパートナーを同定します。
5. 変性条件下でのユビキチン化タンパク質の精製
- ステップ3.3で得られたセルペレットに1 mLの氷冷PBSを加え、均一に混合します。細胞懸濁液100 μL(1/10容量)を投入サンプルとして微量遠心チューブに分注します。
- 700 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収します。80 μLのFlag溶解バッファーを投入サンプルに加え、ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、氷上で細胞を1時間溶解します。
- 8,000 x g で4°Cで20〜30分間遠心分離します。 上清80 μLを新しいマイクロ遠心チューブに分注します。
- 上清に20 μLの5x SDSローディングバッファーを加え、98°Cで5〜10分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、使用するまで-20°Cで保存します。
- 残りの900 μLの細胞懸濁液を700 x gで4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。1 mLのユビキチンバッファー1(UBバッファー1;6 M グアニジン-HCI、0.1 M Na 2 HPO4、6.8 mM NaH 2 PO4、10 mM Tris-HCI(pH 8.0)、および0.2% Triton X-100、新たに10 mM β-メルカプトエタノールと5 mMイミダゾールを添加した)を細胞ペレットに加え、ピペッティングで数回混合して細胞を均等に分配します。
注:イミダゾールの濃度は、ニッケル荷電樹脂への非特異的タンパク質結合を減少させるために、5 mMから20 mMまで変化し得る。ユビキチンバッファーには、リガーゼとDUBの両方を不活性化する塩酸グアニジンが含まれています。β-メルカプトエタノールは、腐った卵に似た強く不快な臭いを持つ無色透明の液体です。高濃度の溶液は、粘膜、上気道、皮膚、および目に深刻な損傷を引き起こします。手袋とゴーグルを着用し、ドラフト内で操作してください。 - 溶液がもはや粘性でなくなるまで、細胞溶解物を超音波の10〜20ラウンドに供する。20 kHZの超音波処理周波数と80%の振幅で氷上で超音波処理を実行し、各パルスは1秒間持続します。8,000 x g でRTで20〜30分間遠心分離し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 30 μLのニッケルチャージ樹脂を上清に加え、15 rpmに設定したローテーターで4時間またはRTで一晩インキュベートします。 1,500 x g でRTで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。
- 1 mLのUBバッファー1を加え、振とう機でRTで10分間回転インキュベートし、1,500 x g でRTで2分間遠心分離してビーズを回収します。
- 1 mLのユビキチンバッファー2(UBバッファー2;8 M尿素、0.1 M Na 2 HPO 4、6.8 mM NaH 2 PO4、10 mM Tris-HCI(pH 8.0)、および0.2% Triton X-100)をビーズに加え、振とう機でRTで10分間回転させてインキュベートし、1,500 x gで2分間遠心分離してビーズを回収します。これをもう一度繰り返します。
- ビーズに1 mLのPBSを加え、振とう機でRTで10分間回転インキュベートし、RTで1,500 x g で2分間遠心分離してビーズを回収します。これをもう一度繰り返します。
- ビーズを最終濃度0.5 Mのイミダゾール40 μLでRTで1時間インキュベートすることにより、結合タンパク質を溶出します。 1,500 x g でRTで2分間遠心分離します。
- 上清を清潔な微量遠心チューブに移し、10 μLの5x SDSローディングバッファーを加え、98°Cで5分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、ウェスタンブロッティング用に-20°Cで保存します。あるいは、未処理の溶出液を-80°Cで保存して、他の下流実験に役立ててください。
6. ウェスタンブロッティングによる精製ユビキチン化タンパク質の検出
- ステップ4.11および5.12のサンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、次にウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜に移し、18に記載されている対応する抗体を使用して標的タンパク質を検出します。
- 簡単に説明すると、TBSTバッファー(15 mM Tris-HCI、pH = 7.6、4.6 mM Tris-Base、150 mM NaCI、使用前に0.1%Tween-20を新たに補充した)中の5%脱脂粉乳を含むブロッキング溶液20 mLにRTで1時間浸漬してメンブレンをインキュベートします。次に、メンブレンを一次抗体とともにRTで2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 各セットに以下の抗体を使用する。全ての一次抗体を1:1000の希釈率で使用した。
- Flag/M2アガロースビーズによる免疫沈降後に抗p53モノクローナル抗体を用いて、ユビキチン化p53を含む総p53タンパク質を検出します。
- Flag/M2アガロースビーズによる免疫沈降後に、抗HA抗体または抗ユビキチン抗体でユビキチン化p53タンパク質を検出します。
- ニッケル荷電樹脂プルダウン後の抗p53モノクローナル抗体でユビキチン化p53タンパク質を検出します。
- ニッケル荷電樹脂プルダウン後の抗HA抗体または抗ユビキチン抗体で総ユビキチン化タンパク質を検出します。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体を用いてメンブレンをRTで1時間インキュベートし、TBSTバッファーで3回洗浄した後、それぞれ5分間インキュベートします。全ての二次抗体を1:3000の希釈率で使用した。次に、膜をTBST緩衝液3倍で5分間ずつ穏やかに撹拌しながら洗浄する。
- 化学発光イメージングシステムを開始し、ウェスタンブロッティングからのシグナルを検出します。溶液Aと溶液Bを1:1の比率で混合することにより、HRP用の基質溶液を調製します。
- ニトロセルロースメンブレンをカメラオブスクラに上向きに置き、ピペッティングガンを使用してメンブレン上に基質溶液を均一にコーティングします。化学発光シグナルをキャプチャするには自動露光手順を選択し、理想的な信号が得られるまで露光時間を手動で調整します。
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Representative Results
この模式図は、フラグタグ付きp53(Flag-p53)およびHis/HA二重タグ付きユビキチン(HH-Ub)タンパク質を示しています(図1A)。ユビキチン化タンパク質を精製するために利用される手順を 図1Bに要約する。ポリHisタグ付きユビキチンは、哺乳類細胞の標的タンパク質にライゲーションすることができます。ユビキチン化タンパク質は、非変性条件下でFlag/M2ビーズで精製するか、変性条件下で固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって精製することができます(図1B)。ユビキチン化p53を含む総p53タンパク質を、非変性条件下でH1299細胞由来のFlag/M2ビーズで免疫沈降しました。これらの細胞でMdm2を異所的に発現させると、低分子から高分子に塗抹したバンドとして現れるユビキチン化p53タンパク質からのシグナルが著しく増加し、ユビキチン化p53タンパク質が細胞から効果的に精製されていることが示唆されました(図2)。次に、細胞を変性条件下で溶解し、全細胞ユビキチン化タンパク質をニッケル荷電樹脂で引き下げた。全細胞タンパク質は抗HAモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出し、ユビキチン化p53タンパク質は抗p53モノクローナル抗体を用いて検出した。結果は、総ユビキチン化タンパク質レベルは変化しなかったが、これらの細胞でMdm2が過剰発現した後、ユビキチン化p53タンパク質レベルが劇的に増加したことを示した。これらの結果は、ユビキチン化p53を含むユビキチンタンパク質全体が、変性条件下で細胞ライセートから効果的に引き下げられることを示しました(図3)。
図1:ユビキチン化タンパク質の精製に利用される手順の概要 。 (A)フラグタグ付きp53(Flag-p53)およびHis/HA二重タグ付きユビキチン(HH-Ub)タンパク質の模式図。(B)ユビキチン化タンパク質は、非変性条件下ではFlag/M2ビーズで、変性条件下ではIMACで精製できます。略語:His/HA =ポリヒスチジン/ヘマグルチニン;Ub=ユビキチン;フラグ/M2ビーズ=抗フラグM2抗体結合ビーズ;IMAC = 固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ユビキチン化p53タンパク質を非変性条件下で精製した。 Flag-p53発現プラスミドを単独で、HH-Ubと共に、またはMdm2およびHH-Ubと共にH1299細胞にトランスフェクトした。総p53タンパク質およびユビキチン化形態は、細胞抽出物からのFlag/M2ビーズによって免疫沈降された。溶出液を抗p53(A)および抗HA(B)モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングに供した。(C)粗細胞抽出物(Input)を抗p53および抗Mdm2モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングに供した。GFPをローディングコントロールとして使用しました。略語:HH-Ub=His/HA二重タグユビキチン;HA =赤血球凝集素;フラグ/M2ビーズ=抗フラグM2抗体結合ビーズ;GFP = 緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ユビキチン化p53タンパク質を変性条件下で精製した。 Flag-p53発現プラスミドを単独で、HH-Ubと共に、またはMdm2およびHH-Ubと共にH1299細胞にトランスフェクトした。細胞ユビキチン化タンパク質全体をニッケル荷電樹脂でプルダウンし、抗p53および抗HAモノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングにかけました。(a)抗p53抗体を用いてユビキチン化p53タンパク質を検出した。(b)抗HA抗体を用いて検出した総ユビキチン化タンパク質。(C)粗細胞抽出物(Input)を抗p53および抗Mdm2モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングに供した。GFPをローディングコントロールとして使用しました。略語:HH-Ub=His/HA二重タグユビキチン;HA =赤血球凝集素;GFP = 緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ユビキチン化は、ほとんどすべての生理学的および病理学的細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします2。近年、シグナル伝達経路におけるユビキチンの分子的役割と、ユビキチン系の変化がどのようにしてさまざまなヒト疾患につながるかを理解する上で大きな進歩が見られました2。ユビキチン化タンパク質の精製は、これらのプロセスにおけるユビキチン化の正確な役割についての洞察を提供することに貢献します。ユビキチン結合タンパク質の混合物は、非変性および変性条件下で細胞から精製することができる。ニッケル樹脂を使用したIMACは、変性条件下でポリHisタグ付きタンパク質を精製するために使用できます。変性条件下でユビキチン化タンパク質を精製する目的は、標的タンパク質から相互作用パートナーを廃棄することです。標的タンパク質に結合するすべての細胞成分は、変性条件下で溶出から削除されます。対照的に、標的タンパク質に結合する一部の細胞タンパク質は、天然条件下で溶出中に保持される可能性があり、下流の実験を妨げる可能性があります。ユビキチン化タンパク質は、ニッケル樹脂への非特異的タンパク質結合を大幅に減少させる強力な変性剤の存在下でも精製することができます。対照的に、ユビキチン化形態を含む全標的タンパク質は、非変性条件下で抗体結合アガロースビーズを用いたエピトープタグ付け戦略によって精製することができる。タンパク質は、このプロセス中に抗体媒介アフィニティー精製が使用されたため、それほどストリンジェントでない条件下で精製されました。標的タンパク質とそのユビキチン化形態は、タンパク質またはユビキチン特異的抗体で検出されました。HAタグ付きタンパク質およびMycタグ付きタンパク質は、抗体結合アガロースビーズと同じ手順で簡便に精製できます。特に、単一または複数のモノユビキチン鎖を持つタンパク質は、タンパク質特異的抗体を持つポリユビキチン鎖を持つタンパク質よりも簡単に検出できます。対照的に、ポリユビキチン鎖を有するタンパク質は、ユビキチン特異的抗体によってより容易に認識され得る。
ユビキチン化タンパク質を効果的に精製するためには、標的タンパク質の発現レベルを哺乳類細胞で高くする必要があります。強力なCMVプロモーターを有する発現ベクターは、細胞内で高レベルのタンパク質発現を達成するために使用できます。また、E3ユビキチンリガーゼとユビキチンは、標的タンパク質と共発現させることができる。ユビキチン部分をタンパク質により効果的に付加します。26Sプロテアソームの活性は、細胞内にユビキチン化タンパク質を蓄積するために、低分子阻害剤によってブロックされ得る。ユビキチン化タンパク質を樹脂に効果的に結合させるためには、細胞抽出物を短時間超音波処理してDNA複合体を破壊し、溶液を非粘性にする必要があります。非特異的結合を減少させるには、変性条件下で低濃度のイミダゾールを溶解バッファーに添加する必要があります。非常に高い分子量のユビキチン化タンパク質は、変性およびリフォールディング手順の後に樹脂と簡単につなぎ合わせることができます。溶出効率を上げるために、高濃度のイミダゾールを使用してみてください。溶出効率が極端に低い場合は、SDS Laemmliローディングバッファーで直接煮沸してユビキチン化タンパク質を溶出してみてください。樹脂に結合したユビキチン化タンパク質のほとんどは、この強力な変性バッファーで溶出できます。ユビキチン化タンパク質のより高い純度を達成するために、2段階のアフィニティー精製を適応させることができる。非変性条件下でのFlag/M2免疫沈降の後、ニッケル荷電樹脂による第2段階の精製を使用して、Hisタグ付きユビキチン化タンパク質をプルダウンし、非ユビキチン化基質を取り除くことができます。対照的に、変性条件下でニッケル荷電樹脂プルダウンした後、第2のアフィニティー精製ステップは、抗フラッグまたは抗HA抗体結合アガロースビーズによるエピトープタグ付け戦略を使用して標的タンパク質を免疫沈降するように適合させることができる。
この研究では、小規模な精製を行ったため、銀染色やクーマシー染色の代わりに、より感度の高いイムノブロッティングを使用してユビキチン化タンパク質を検出しました。実際、一部の細胞タンパク質は細胞内で容易にユビキチン化されていますが、ユビキチン部分とライゲーションできるタンパク質はごく一部です。銀染色またはクーマシー染色によってこれらのタンパク質を正常に検出するには、大規模な精製を行う必要があります。ユビキチン化タンパク質の純度を高めるには、第2のアフィニティー精製ステップも行う必要があります。このプロトコルで精製されたユビキチン化タンパク質は、ダウンストリーム分析の要件を完全に満たしているため、これらの実験は行わなかった。例えば、ユビキチン化によって制御される標的タンパク質の特異的DUBを同定するためには、大量のユビキチン化標的タンパク質を精製する必要があります。これらのタンパク質は、脱ユビキチン化バッファー中で哺乳類細胞から精製された個々のDUBと共にインキュベートすることができます。この in vitro ハイスループットスクリーニングにより、哺乳類細胞における標的タンパク質に特異的なDUBを同定することができます。
この手法にはいくつかの制限があります。ユビキチン化タンパク質は標的タンパク質のごく一部を占めており、大量のユビキチン化標的タンパク質を精製することは困難である。高い精製効率を達成するために、細胞内のタンパク質発現をスケールアップしてみてください。別の方法は、より多くのユビキチン化タンパク質を取得するために in vitro ユビキチン化反応を行うことである。一部のタンパク質は哺乳類細胞で高発現することが難しく、ユビキチン化タンパク質の大量精製には別の制限があります。最後に、現在のプロトコルは、プラスミドDNAを使用して過剰発現されるタグ付きタンパク質の精製に限定されています。標的タンパク質の発現レベルは、内因性標的タンパク質の発現レベルよりも高い。標的タンパク質の内因性ユビキチン化状態を評価するために、ユビキチン化された形態を有するタンパク質を、細胞由来の標的タンパク質特異的抗体によって直接免疫沈降することができる。抗ユビキチン抗体は、標的タンパク質のユビキチン化状態を決定するために使用することができる。しかしながら、状況によっては、より低い発現レベル、より低いユビキチン化標的タンパク質レベル、またはより低い特異的抗体の免疫沈降効率は、哺乳動物細胞からの内因性標的タンパク質のユビキチン化状態の検出を制限し得る。現在のプロトコルは、代わりに実験システムを提供してもよい。
p53腫瘍抑制タンパク質は、正常細胞の悪性形質転換を予防する上で重要な役割を果たす8、9、10、11。p53の安定性は、細胞内のユビキチン化を介した分解によって厳密に制御されています。Mdm2はE3ユビキチンリガーゼとして作用し、用量依存的にp53モノおよびポリユビキチン化を促進する16。ここで、ユビキチン化p53タンパク質を、Mdm2過剰発現の存在下で哺乳動物細胞において変性および非変性条件下で精製した。モノユビキチン化p53タンパク質は抗p53モノクローナル抗体で優先的に検出されましたが、ポリユビキチン化形態はユビキチン特異的抗体で簡単に検出されました。ポリユビキチン化形態のレベルは、細胞におけるMdm2の発現を上昇させることによって効果的に増加させることができる。この論文は、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割を解明するために、ユビキチン化タンパク質の調製のための理想的な実験システムを提供します。ユビキチン化タンパク質は、標的タンパク質の特定のDUBを同定し、シグナル伝達におけるさまざまなタイプのユビキチン鎖、例えばK48およびK63結合鎖の役割を明らかにするために使用できます。このプロトコルは、タンパク質間相互作用およびタンパク質複合体形成におけるユビキチン化の役割を調べるために使用できます。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81972624)からD.L.への助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M.
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J.
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J.
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).
