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Bioengineering

मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नैनोकणों के सेलुलर अपटेक की बायोमोलेक्यूलर इमेजिंग

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63637
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एक वर्णक्रमीय-फोकसिंग मॉड्यूल और एक दोहरे-आउटपुट पल्स लेजर के एकीकरण को प्रस्तुत करता है, जो सोने के नैनोकणों और कैंसर कोशिकाओं के तेजी से हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग को सक्षम करता है। इस काम का उद्देश्य एक मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल तकनीकों के विवरण को प्रदर्शित करना है।

Abstract

जीवित प्रणालियों में सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) की जांच करना एयूएनपी और जैविक ऊतकों के बीच बातचीत को प्रकट करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, एक इमेजिंग प्लेटफॉर्म में उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस), दो-फोटॉन उत्तेजित फ्लोरेसेंस (टीपीईएफ), और क्षणिक अवशोषण (टीए) जैसे नॉनलाइनर ऑप्टिकल सिग्नल को एकीकृत करके, इसका उपयोग सेलुलर संरचनाओं और एयूएनपी के बायोमोलेक्यूलर कंट्रास्ट को मल्टीमॉडल तरीके से प्रकट करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख एक मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत करता है और इसे कैंसर कोशिकाओं में एयूएनपी की रासायनिक रूप से विशिष्ट इमेजिंग करने के लिए लागू करता है। यह इमेजिंग प्लेटफॉर्म अधिक कुशल कार्यात्मक एयूएनपी विकसित करने और यह निर्धारित करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है कि क्या वे ट्यूमर, पेरीसेलुलर या सेलुलर रिक्त स्थान के आसपास वास्कुलचर के भीतर हैं।

Introduction

सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) ने बायोकंपैटिबल इमेजिंग जांच के रूप में बड़ी क्षमता दिखाई है, उदाहरण के लिए, विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में प्रभावी सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईआरएस) सब्सट्रेट के रूप में। प्रमुख अनुप्रयोगों मेंकैंसर उपचार के लिए बायोसेंसिंग, बायोइमेजिंग, सतह-संवर्धित स्पेक्ट्रोस्कोपी और फोटोथर्मल थेरेपी जैसे क्षेत्र शामिल हैं। इसके अलावा, जीवित प्रणालियों में एयूएनपी की जांच करना एयूएनपी और जैविक प्रणालियों के बीच बातचीत का आकलन और समझने के लिए महत्वपूर्ण है। फूरियर ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड (एफटीआईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी2, लेजर एब्लेशन अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलए-आईसीपी-एमएस)3, और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)4 सहित विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकें हैं जिनका उपयोग ऊतकों में एयूएनपी के वितरण की जांच के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। फिर भी, ये विधियां कई कमियों से ग्रस्त हैं जैसे कि समय लेने वाली और जटिल नमूना तैयारी3 को शामिल करना, लंबे अधिग्रहण समय की आवश्यकता होती है, या उप-माइक्रोन स्थानिक संकल्प 2,4 की कमी होती है।

पारंपरिक इमेजिंग तकनीकों की तुलना में, नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी लाइव कोशिकाओं और एयूएनपी की जांच के लिए कई फायदे प्रदान करती है: नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी गहरी इमेजिंग गहराई प्राप्त करती है और निकट-आईआर अल्ट्राफास्ट लेजर के उपयोग के साथ आंतरिक 3 डी ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता प्रदान करती है। इमेजिंग गति और पहचान संवेदनशीलता के महत्वपूर्ण सुधार के साथ, दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) 5,6,7 और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) 8,9,10 माइक्रोस्कोपी को जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में अंतर्जात बायोमोलेक्यूल्स के गैर-इनवेसिव इमेजिंग में और सुधार करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, क्षणिक अवशोषण (टीए) 11,12,13,14 और उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) 15,16,17,18 जैसे नए पंप-प्रोब नॉनलाइनियर ऑप्टिकल तकनीकों का उपयोग करके, सेलुलर संरचनाओं और एयूएनपी के लेबल-मुक्त जैव रासायनिक विपरीत प्राप्त करना संभव है। बाह्य लेबल के उपयोग के बिना एयूएनपी की कल्पना करना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि नैनोकणों के रासायनिक गड़बड़ी उनके भौतिक गुणों को संशोधित करेंगे और इसलिए कोशिकाओं में उनका उत्थान होगा।

यह प्रोटोकॉल दोहरी-तरंग दैर्ध्य पल्स लेजर के लिए स्पेक्ट्रल फोकसिंग टाइमिंग एंड रिकॉम्बिनेशन यूनिट (एसएफ-टीआरयू) मॉड्यूल के कार्यान्वयन को प्रस्तुत करता है, जो एयूएनपी और कैंसर कोशिकाओं की तेजी से मल्टीमॉडल इमेजिंग को सक्षम करता है। इस काम का उद्देश्य लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर एकीकृत टीपीईएफ, टीए और एसआरएस तकनीकों के विवरण को प्रदर्शित करना है।

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Protocol

1. लेजर सिस्टम पर स्विच करना

  1. इंटरलॉक सिस्टम पर स्विच करें और सिस्टम शुरू करने से पहले आर्म लेजर का चयन करें।
  2. डुअल-आउटपुट फेम्टोसेकंड लेजर को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ पीसी चालू करें।
  3. दोहरे आउटपुट फेम्टोसेकंड लेजर के लिए सॉफ्टवेयर लोड करें; यह सॉफ्टवेयर लेजर को चालू और बंद करने में सक्षम बनाता है और सीधे पंप बीम की तरंग दैर्ध्य को नियंत्रित करता है।
  4. 3 की गिनती के लिए पावर आइकन को दबाकर लेजर उत्सर्जन पर स्विच करें।
  5. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि लेजर गर्म न हो जाए और सॉफ्टवेयर में लेजर-तैयार प्रकाश हरे रंग से जलाया जाए।
  6. पंप बीम की तरंग दैर्ध्य सीधे सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित होती है; यह 680-1,300 एनएम तक हो सकता है। सी-एच रमन कंपन क्षेत्र में सेलुलर इमेजिंग के लिए, 802 एनएम का चयन करें।
  7. 3 सेकंड के लिए एपर्चर छवियों को पकड़कर असमर्थ पंप बीम और 1,045 एनएम स्टोक्स बीम के शटर खोलें।
    सावधानी: लेजर सुरक्षा मार्गदर्शन दोहरी-आउटपुट फेम्टोसेकंड लेजर एक श्रेणी IV इन्फ्रा-रेड स्पंदित लेजर है और आंखों की रोशनी को स्थायी नुकसान पहुंचा सकता है। इसलिए, इस प्रक्रिया को करते समय सभी लेजर सुरक्षा स्थानीय नियमों का पालन किया जाना चाहिए: (i) केवल अधिकृत उपयोगकर्ता जिन्होंने लेजर सुरक्षा प्रशिक्षण प्राप्त किया है, प्रक्रिया को पूरा कर सकते हैं। (ii) प्रयोगशाला में प्रवेश कमरे के दरवाजे पर एक इंटरलॉक के साथ स्वाइप कार्ड एक्सेस के माध्यम से होता है। (iii) अधिकांश प्रचालनों के लिए लेजर बीम पूरी तरह संलग्न होते हैं। (iv) जब लेजर बीम उजागर होता है, तो लेजर सुरक्षा चश्मे पहने जाने चाहिए (एलजी 9 लेजर सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें, जो पंप और स्टोक्स बीम दोनों के ओडी 7 + ब्लॉकिंग देते हैं)।

2. स्पेक्ट्रल फोकसिंग टाइमिंग एंड रिकॉम्बिनेशन यूनिट (एसएफ-टीआरयू) पर स्विच करना

  1. लेजर सॉफ्टवेयर के साथ उसी पीसी पर एटीएम सॉफ्टवेयर लोड करें, जो एसएफ-टीआरयू यूनिट में देरी चरणों और लेजर एटेन्यूएटर को नियंत्रित करता है।
    नोट: यह इकाई यह सुनिश्चित करने के लिए जिम्मेदार है कि पंप और स्टोक्स बीम स्थानिक रूप से अतिव्यापी हैं, पंप और स्टोक्स बीम में फैलाव को नियंत्रित करते हैं, और पंप और स्टोक्स बीम के बीच समय की देरी को नियंत्रित करते हैं। पंप और स्टोक्स बीम दोनों का ध्रुवीकरण ऊर्ध्वाधर है। ध्यान दें कि प्रत्येक बीम एसएफ-टीआरयू से बाहर निकलने से पहले ध्रुवीकरण को स्वतंत्र रूप से नियंत्रित करने के लिए एक अर्ध-तरंग प्लेट से लैस है।
  2. सुनिश्चित करें कि पंप और स्टोक्स लेजर दोनों <10% (पंप) और <15% (स्टोक्स बीम) तक क्षीण हो जाते हैं। यदि बीम क्षीण नहीं होते हैं, तो लेजर शक्ति सिस्टम को नुकसान पहुंचा सकती है और जैविक नमूने जला देगी।
  3. सेलुलर इमेजिंग के लिए, नमूने में 12 mW और 30 mW के अनुरूप इष्टतम लेजर सेटिंग्स को 6% (पंप) और 10% (स्टोक्स) पर सेट करें।
  4. एसएफ-टीआरयू में दो सेटिंग्स हैं: फेम्टोसेकंड (एफएस) मोड और पिकोसेकंड (पीएस) मोड।
  5. एफएस मोड के लिए, बॉक्स के दोनों ओर नॉब्स में धक्का दें (यह बीम पथ से फैलाव झंझरी को हटा देता है)।
  6. पीएस मोड के लिए, बॉक्स के दोनों ओर नॉब्स को बाहर निकालें (यह बीम पथ में फैलाव झंझरी रखता है)।
  7. हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग के लिए, पीएस मोड का चयन करें।
  8. सुनिश्चित करें कि देरी चरण पंप के लिए सही स्थिति में है और स्टोक्स बीम इस प्रणाली पर सी-एच इमेजिंग के लिए अस्थायी रूप से अतिव्यापी हैं।
  9. सुनिश्चित करें कि पंप और स्टोक्स बीम की फैलाव सेटिंग्स सही हैं; 802 एनएम पंप के लिए, यह पंप बीम के लिए 5 मिमी और स्टोक्स बीम के लिए 30 मिमी है।

3. एसआरएस इमेजिंग के लिए स्टोक्स बीम को संशोधित करना

  1. एसआरएस का पता लगाने के लिए, स्टोक्स बीम की तीव्रता को संशोधित करें।
  2. बीम मॉड्यूलेशन के लिए सिग्नल जनरेटर चालू करें।
  3. पिछली सेटिंग्स को याद करें, जो निम्नानुसार हैं:
    आउटपुट 1: वर्ग तरंग: आवृत्ति = 19.5 मेगाहर्ट्ज, आयाम = 1.4 वी।
    आउटपुट 2: वर्ग तरंग: आवृत्ति = 19.5 मेगाहर्ट्ज, आयाम = 300 एमवी।
  4. आउटपुट 1 और 2 पर स्विच करें।
  5. आउटपुट 1 को बीएनसी केबल के माध्यम से एसएफ-टीआरयू बॉक्स में ईओएम के लिए एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
  6. आउटपुट 2 को बीएनसी केबल के माध्यम से एसआरएस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले लॉक-इन एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
  7. गैन्ट्री पर एम्पलीफायर को बिजली की आपूर्ति चालू करें।

4. लॉक-इन एम्पलीफायर पर स्विच करना

  1. एसआरएस इमेजिंग के लिए, एसआरएस डिटेक्शन मॉड्यूल का उपयोग करें जिसमें एक बड़ा क्षेत्र फोटोडायोड और एक उद्देश्य-निर्मित लॉक-इन एम्पलीफायर शामिल है।
  2. गैन्ट्री पर लॉक-इन एम्पलीफायर को बिजली की आपूर्ति चालू करें।
  3. पीसी पर लॉक-इन एम्पलीफायर "एसआरएस डिटेक्शन मॉड्यूल" के लिए सॉफ्टवेयर लोड करें।
  4. सॉफ्टवेयर में, निम्नलिखित सेटिंग्स चुनें: चरण = 0 °, ऑफसेट = -80 mW, लाभ = 58 dB।
  5. सॉफ्टवेयर में लॉक-इन एम्पलीफायर एकीकरण समय स्थिरांक का चयन करें: सेल इमेजिंग के लिए 2 μ का समय स्थिरांक अच्छी गुणवत्ता वाली छवियां देता है।

5. लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर काम करना

  1. रिमोट-कंट्रोल बॉक्स को छोड़कर सभी उपकरणों के प्लग चालू करें। गैन्ट्री के शीर्ष पर स्थित नियंत्रण बॉक्स पर स्टैंडबाय जलाए जाने तक प्रतीक्षा करें।
  2. गैन्ट्री पर रिमोट-कंट्रोल बॉक्स पर स्विच करें और बॉक्स के पीछे स्विच करें। दूरस्थ प्रकाश के नीले होने तक प्रतीक्षा करें (नियंत्रण बॉक्स पर), और कार्रवाई प्रारंभ दबाएँ.
  3. लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के पीसी को चालू करें।
  4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर चलाएं।
  5. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के माध्यम से माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ की जांच करें।
    नोट: एसआरएस इमेजिंग के लिए उपयुक्त बनाने के लिए माइक्रोस्कोप में कुछ संशोधन किए गए हैं: (i) बीम पथ में, फ़िल्टर व्हील में 775 एनएम शॉर्ट पास जोड़ा गया है जहां लेजर बीम स्कैन यूनिट में प्रवेश करते हैं, इसे कंप्यूटर सॉफ्टवेयर में लाइटपाथ टैब में चुना जा सकता है। (ii) पता लगाने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के इनबिल्ट पीएमटी का उपयोग करने के बजाय, संचारित प्रकाश पथ में एक बीस्पोक डिटेक्टर जोड़ा गया है, जो एसआरएस और कार्स दोनों का पता लगाने की अनुमति देता है। (iii) इन डिटेक्टरों के आउटपुट गैन्ट्री पर एनालॉग बॉक्स से जुड़े होते हैं। पीएमटी से कार्स सिग्नल एक बीएनसी केबल के माध्यम से सीडी 1 से जुड़ा होता है और लॉक-इन एम्पलीफायर से एसआरएस सिग्नल बीएनसी केबल के माध्यम से सीडी 2 से जुड़ा होता है।
  6. टच स्क्रीन या रिमोट-कंट्रोल नॉब्स या कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर के माध्यम से फ़ोकस को नियंत्रित करें।
  7. सॉफ़्टवेयर में वांछित छवि सेटिंग्स का चयन करें; इसमें ज़ूम, पिक्सेल में छवि आकार और पिक्सेल निवास समय शामिल हैं।
  8. सुनिश्चित करें कि इमेजिंग गति (पिक्सेल निवास समय) लॉक-इन एम्पलीफायर सॉफ़्टवेयर में सेट एकीकरण समय से अधिक है।
    नोट: इमेजिंग के लिए एनए 1.2 जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया गया था।

6. माइक्रोस्कोप चरण में एक नमूना माउंट करना

  1. निम्नानुसार इमेजिंग के लिए सेल नमूने तैयार करें।
    1. आरपीएमआई -1640 में कल्चर 4 टी 1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं को 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक किया गया। हर 2 दिनों में माध्यम बदलें और कोशिकाओं को 70% -80% संगम पर पारित करें।
      नोट: यहां वर्णित प्रयोगों के दौरान अंश 8-10 का उपयोग किया गया था।
    2. इमेजिंग प्रयोगों के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस,5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए स्क्वायर कवरलिप्स पर 1 x 10 5 कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, कोशिकाओं को पूर्व-गर्म फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ धोएं और सोने के नैनोकणों (सेल कल्चर माध्यम में 1: 100 कमजोर पड़ने, स्टॉक एकाग्रता: 2.3 x10 10 कण / एमएल, व्यास: 60 एनएम) के साथ 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. इमेजिंग से पहले, कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ धोएं और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें। कोशिकाओं को पीबीएस 3 एक्स के साथ धोएं, और फिर इमेजिंग के लिए दो कवरलिप्स के बीच माउंट करें।
  2. जल विसर्जन उद्देश्य के शीर्ष पर आसुत जल की एक बूंद रखें जो उद्देश्य और नमूने के बीच नमूने में लेजर बीम को केंद्रित करता है। फिर, माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें।
  3. एनए 1.4 के साथ एक कंडेनसर आगे प्रचारित प्रकाश को इकट्ठा करता है। इमेजिंग के लिए कंडेनसर और नमूने के बीच पानी की एक बूंद लागू करें। प्रकाश की अधिकतम मात्रा एकत्र करने के लिए नमूने से लगभग 1 मिमी ऊपर कंडेनसर की ऊंचाई समायोजित करें।
  4. एसआरएस डिटेक्टर एक मूवेबल माउंट पर है, जो इसे संग्रह ऑप्टिकल मार्ग से अंदर और बाहर स्लाइड करने की अनुमति देता है। सफेद प्रकाश का उपयोग करके नमूने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, एसआरएस डिटेक्टर को बीम पथ से बाहर ले जाएं।
  5. डिटेक्टर को बीम पथ में वापस रखें, एसआरएस इमेजिंग के लिए तैयार।

7. रमन शिफ्ट को बदलना और हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा स्टैक एकत्र करना

नोट: रमन शिफ्ट जिस पर इमेजिंग होती है, वह एसएफ-टीआरयू बॉक्स में देरी चरण की स्थिति और लेजर सिस्टम से पंप बीम की तरंग दैर्ध्य पर निर्भर है।

  1. रमन शिफ्ट में बड़े बदलाव के लिए लेजर तरंगदैर्ध्य बदलें। उदाहरण के लिए, 2,800-3,100 सेमी-1 के बीच इमेजिंग सीएच कंपन के लिए, 802 एनएम का चयन करें, जबकि, एमाइड आई पीक के लिए लगभग 1,600 सेमी -1 इमेजिंग के लिए, 898 एनएम पर पंप बीम का चयन करें। इसे सॉफ्टवेयर के माध्यम से समायोजित करें।
  2. रमन शिफ्ट में छोटे समायोजन प्राप्त करने के लिए, एसएफ-टीआरयू इकाई में देरी चरण को स्कैन करें।
  3. एसएफ-टीआरयू मिलीमीटर (मिमी) में देरी चरण की स्थिति देता है। देरी चरण की स्थिति को मिमी से सेमी -1 में बदलने के लिए, पॉलीस्टाइनिन मोतियों के नमूने का उपयोग करके अंशांकन हाइपरस्पेक्ट्रल स्कैन करें और अंशांकन स्कैन में पाए जाने वाले शिखर पदों की तुलना सहज रमन सेटअप पर लिए गए लोगों के साथ करें। यह एक रैखिक समीकरण प्रदान करेगा, जो मिमी में देरी चरण की स्थिति को सेमी -1 में रमन शिफ्ट में परिवर्तित करता है।
  4. हाइपरस्पेक्ट्रल स्कैन उत्पन्न करने के लिए, विभिन्न विलंब चरण स्थितियों पर छवियों की एक समय श्रृंखला लें।
  5. देरी चरण की छवि अधिग्रहण और आंदोलन को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, एसएफ-टीआरयू सिस्टम से टीटीएल सिग्नल भेजने और प्राप्त करने के लिए एनालॉग यूनिट का उपयोग करें।
    नोट: ऐसा करने के लिए, एनालॉग बॉक्स में निम्नलिखित कनेक्शन हैं: (i) TRIG OUT VD1- यह एक BNC के माध्यम से SF-TRU से जुड़ा हुआ है और +1 वेतन वृद्धि को स्थानांतरित करने के लिए देरी चरण को बताने के लिए एक TTL सिग्नल भेजता है। (ii) TRIG 1 में- यहां, बीएनसी के माध्यम से एक संकेत प्राप्त होता है जब देरी चरण अपनी गति समाप्त कर देता है, और इसका उपयोग समय श्रृंखला में अगली छवि को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है।
  6. हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा सेट के लिए, confocal माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर में निम्न सेटिंग्स का चयन करें:
    1. ट्रिगर टैब में, TTL ट्रिगर (ON) और ट्रिगर (प्रत्येक फ़्रेम) द्वारा प्रारंभ करें का चयन करें.
    2. श्रृंखला टैब में, समय श्रृंखला चालू और जेड श्रृंखला बंद सेट करें।
    3. एटीएम सॉफ्टवेयर में चरणों की संख्या से मेल खाने के लिए समय श्रृंखला में फ्रेम की संख्या सेट करें (101 चरणों का उपयोग यहां किया जाता है)।
  7. एटीएम सॉफ्टवेयर में रन टैब पर जाएं।
    1. हाइपरस्पेक्ट्रल स्कैन की शुरुआत और स्टॉप के लिए मिलीमीटर में देरी चरण की स्थिति सेट करें। सीएच उच्च तरंग संख्या क्षेत्र के लिए, प्रारंभ स्थिति = 90.25 मिमी और स्टॉप स्थिति = 92.25 मिमी का उपयोग करें।
    2. सुनिश्चित करें कि चरणों की संख्या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में फ्रेम की संख्या से मेल खाती है।
  8. सही सेटिंग्स की जांच करने के बाद, पहले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में हाइपरस्पेक्ट्रल स्टैक शुरू करें। अधिग्रहण पर जाएं और स्टार्ट स्कैन पर क्लिक करें। फिर, एटीएम सॉफ्टवेयर में, स्टार्ट पर क्लिक करें। यह छवियों की एक श्रृंखला का संग्रह शुरू करता है, जिसमें चयनित प्रारंभ और स्टॉप स्थितियों के बीच देरी चरण की स्थिति में वृद्धिशील वृद्धि होती है
  9. हाइपरस्पेक्ट्रल छवि श्रृंखला को मल्टी-फ्रेम .tif फ़ाइल के रूप में निर्यात करें और अंशांकन करने के लिए एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करें।
  10. एक बार अंशांकन पूरा हो जाने के बाद, विलंब चरण की स्थिति को रमन शिफ्ट में बदलने के लिए रैखिक अंशांकन समीकरण का उपयोग करें।
  11. सीएच कंपन क्षेत्र (2,800-3,100 सेमी-1) में इमेजिंग के बीच स्विच करने के लिए एमाइड आई कंपन क्षेत्र 1,500-1,700 सेमी -1, निम्नलिखित करें।
    1. लेजर सॉफ्टवेयर में पंप तरंग दैर्ध्य को 802 एनएम से 898 एनएम तक बदलें।
    2. एटीएम सॉफ्टवेयर में स्टोक्स फैलाव सेटिंग को 30 मिमी से 5 मिमी तक बदलें।
    3. एसएफ-टीआरयू बॉक्स के अंदर पंप बीम फैलाव मार्ग में दर्पण में एक छोटा समायोजन करें। यह दर्पण माउंट पर निचले नॉब को समायोजित करके किया जाता है, जो दर्पण कोण को एक वृद्धिशील राशि से बदलता है।
    4. एमाइड I क्षेत्र पर हाइपरस्पेक्ट्रल स्कैन करते समय, एटीएम सॉफ्टवेयर में स्टार्ट और स्टॉप पोजीशन को क्रमशः 89 और 91 मिमी पर सेट करें
      सावधानी: लेजर सुरक्षा चश्मे को इस चरण के लिए पहना जाना चाहिए क्योंकि लेजर बीम उजागर हो जाएगा।

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Representative Results

स्पेक्ट्रल फोकसिंग टाइमिंग एंड रिकॉम्बिनेशन यूनिट (एसएफ-टीआरयू) मॉड्यूल को दोहरे-आउटपुट फेम्टोसेकंड लेजर और संशोधित लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के बीच पेश किया गया है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले असमर्थ अल्ट्राफास्ट लेजर सिस्टम में दो आउटपुट पोर्ट हैं जो एक बीम को एक निश्चित 1,045 एनएम तरंग दैर्ध्य पर और दूसरे बीम को 680-1,300 एनएम की सीमा में प्रदान करते हैं। एसएफ-टीआरयू मॉड्यूल और मल्टीमॉडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म का एक विस्तृत योजनाबद्ध चित्र 1 में दर्शाया गया है। एसएफ-टीआरयू का उपयोग दो फेम्टोसेकंड लेजर बीम को पिकोसेकंड दालों में चहचहाने के लिए किया जाता है और दो बीम को स्थानिक और अस्थायी रूप से ओवरलैप करता है। हाइपरस्पेक्ट्रल उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) इमेजिंग पिकोसेकंड पंप और स्टोक्स दालों के बीच देरी को स्कैन करके की जाती है।

सभी नमूने एक संशोधित उल्टे माइक्रोस्कोप पर एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य के माध्यम से स्पंदित लेजर द्वारा रोशन किए जाते हैं। एसआरएस और टीपीईएफ सिग्नल को उच्च एनए कंडेनसर के साथ आगे की दिशा में एकत्र किया जाता है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए, क्रमशः पंप और स्टोक्स बीम के रूप में असमर्थ (680-1,300 एनएम) और फिक्स्ड (1,045 एनएम) लेजर आउटपुट का उपयोग किया जाता है। एसआरएस इमेजिंग करने के लिए एक बड़े क्षेत्र के फोटोडायोड और लॉक-इन एम्पलीफायर के संयोजन का उपयोग किया जाता है, जबकि स्टोक्स बीम को दो फिल्टर (890/210 बैंड-पास और 950 एनएम शॉर्ट-पास फिल्टर) के साथ अवरुद्ध किया जाता है। पिकोसेकंड लेजर-आधारित प्रणालियों पर वर्णक्रमीय फोकसिंग एसआरएस दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण लाभ चहकने वाले पंप और स्टोक्स दालों के बीच समय की देरी को नियंत्रित करके रमन शिफ्ट ऑफ इंटरेस्ट को ट्यून करने की क्षमता है। यह दृष्टिकोण पंप और स्टोक्स तरंग दैर्ध्य को बदले बिना कई सौ तरंग संख्याओं की सीमा के भीतर रमन शिफ्टों की तेजी से जांच करने की अनुमति देता है, जिससे बहुत तेजी से हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग की अनुमति मिलती है।

वर्णक्रमीय संकल्प और रासायनिक चयनात्मकता के प्रदर्शन को मान्य करने के लिए, पॉलीस्टाइनिन (पीएस) माइक्रोसेफर्स का नमूना पहले चित्रित किया गया है (चित्रा 2)। नमूने पर लेजर शक्तियां (60x NA 1.2 जल विसर्जन उद्देश्य के बाद) 1,045 nm स्टोक्स बीम के लिए 10 mW और 802 nm पंप बीम के लिए 20 mW हैं। एसआरएस स्पेक्ट्रम को फ्रेम में हर पिक्सेल पर निकाला जा सकता है। चित्रा 2 बी पीएस मोतियों के हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस स्पेक्ट्रम को दर्शाता है। तुलना के लिए, पीएस मोतियों के सहज रमन स्पेक्ट्रम को चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। पीएस माइक्रोसेफर्स के एसआरएस और सहज रमन स्पेक्ट्रा पक्षों में सापेक्ष तीव्रता अंतर को छोड़कर लगभग समान हैं। ये स्पेक्ट्रोस्कोपिक माप एसआरएस इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल देरी लाइन स्टेज (मिमी) को रमन वेवनंबर (सेमी -1) में परिवर्तित करने की अनुमति देते हैं।

चूंकि कार्बन-हाइड्रोजन स्ट्रेचिंग कंपन बैंड में प्रमुख बायोमोलेक्यूल्स का रमन स्पेक्ट्रा 2,800-3,050 सेमी -1 की सीमा में है, इसलिए 4टी 1 कैंसर कोशिकाओं की एसआरएस इमेजिंग 2,852 सेमी -1 (लिपिड), 2,930 सेमी -1 (प्रोटीन), 2,968 सेमी -1 (डीएनए), और ओवरले छवियों पर की जाती है जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। विभिन्न रमन बैंड की एसआरएस छवियों को 512 x 512 पिक्सेल के फ्रेम आकार पर 4 μs के पिक्सेल निवास समय के साथ प्राप्त किया जाता है।

अंत में, इस विधि ने सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) के साथ खुराक किए गए 4 टी 1 कैंसर कोशिकाओं की मल्टीमॉडल इमेजिंग तक विस्तार किया है, जिससे हमें कैंसर कोशिकाओं में एयूएनपी के वितरण को अधिक सटीक रूप से चित्रित करने की अनुमति मिलती है। अधिग्रहित एसआरएस (सीएच2 और सीएच3 चैनल), टीपीईएफ (लाइसोट्रैकर फ्लोरोसेंट प्रोब्स), और टीए (ऑफ-रेजोनेंस एसआरएस चैनल) छवियों को चित्रा 4 में दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: हाइपरस्पेक्ट्रल मल्टीमॉडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म का योजनाबद्ध। मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का चित्रण। डीएम, डाइक्रोइक दर्पण; डीएस, देरी चरण; ईओएम, इलेक्ट्रो-ऑप्टिकल मॉड्यूलेटर; एफजी, फ़ंक्शन जनरेटर; एफएल, फिल्टर; जी, झंझरी; एलआईए, लॉक-इन एम्पलीफायर; एम, दर्पण; ओबीजे, उद्देश्य; पीडी, फोटोडायोड; पीएमटी, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब; एसएफ-टीआरयू, स्पेक्ट्रल फोकसिंग टाइमिंग, और रिकॉम्बिनेशन यूनिट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पॉलीस्टाइनिन (पीएस) माइक्रोसेफर्स का स्पेक्ट्रा। पीएस माइक्रोसेफर्स का सहज (ए) रमन स्पेक्ट्रम (बी) हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस स्पेक्ट्रम के साथ अच्छा समझौता दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 4 टी 1 कैंसर कोशिकाओं की स्पेक्ट्रोस्कोपिक एसआरएस इमेजिंग। एसआरएस छवियां 2,852 सेमी-1, 2,930 सेमी-1, 2,968 सेमी-1, और ओवरले छवि। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 4 टी 1 कैंसर कोशिकाओं द्वारा सोने के नैनोकणों की मल्टीमॉडल इमेजिंग। हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस छवियां 2,852 सेमी-1 (सीएच 2), 2,928 सेमी-1 (सीएच 3), 3,080 सेमी-1 (ऑफ-रेजोनेंस, केवल टीए सिग्नल बाएं), टीपीईएफ और ओवरले छवि। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन ने एसएफ-टीआरयू मॉड्यूल और अल्ट्राफास्ट डुअल-आउटपुट लेजर सिस्टम के संयोजन को प्रस्तुत किया है, जो मल्टीमॉडल माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए अपने अनुप्रयोगों का प्रदर्शन करता है। कैंसर कोशिकाओं द्वारा सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) की जांच करने की अपनी क्षमता के साथ, मल्टीमॉडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म हाइपरथर्मिक कैंसर उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की कल्पना कर सकता है जब लेजर बीम एयूएनपी द्वारा अवशोषित होते हैं।

इसके अलावा, प्रत्येक लेजर बीम में चहचहाहट को नियंत्रित करने के लिए ग्रेटिंग जोड़े के दो सेटों का उपयोग करके, वर्णक्रमीय फोकसिंग तकनीक को नियोजित करके तेजी से रासायनिक रूप से विशिष्ट इमेजिंग और उच्च वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है। चहचहाने के लिए निश्चित लंबाई वाले ग्लास रॉड के उपयोग की तुलना में, ग्रेटिंग जोड़े वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन और रमन लाइनों की रेखा चौड़ाई से मेल खाने की अनुमति देतेहैं।

इसके अलावा, माइक्रोस्कोप के अंदर संरेखण को प्रभावित किए बिना बीम पथ से झंझरी को हटाने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए मैनुअल स्लाइडर्स का उपयोग करके इस प्रणाली को आसानी से फेम्टोसेकंड से चहचहाते पिकोसेकंड शासन में स्विच किया जा सकता है। उच्च संवेदनशीलता और वर्णक्रमीय संकल्प प्राप्त करने के लिए, एसआरएस को आमतौर पर नैरोबैंड पिकोसेकंड पंप और स्टोक्स दालों का उपयोग करके लागू किया जाता है। हालांकि, पिकोसेकंड लेजर मल्टीफोटॉन उत्तेजना के लिए पर्याप्त नहीं हैं जिनके लिए उच्च शिखर शक्ति स्तर की आवश्यकता होती है, जो फेम्टोसेकंड लेजर के साथ प्राप्त करने योग्य हैं। मल्टीमॉडल क्षमताएं मल्टीफोटॉन इमेजिंग20, सुसंगत रमन स्कैटरिंग21 और पंप-प्रोब स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए विधि का उपयोग करने की अनुमति देती हैं।

कई रणनीतियाँ हैं जिनका उपयोग प्रदर्शित डिवाइस के प्रदर्शन को और बेहतर बनाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक तेज-मोटरचालित देरी लाइन चरण और डेटा-अधिग्रहण सॉफ्टवेयर एक उच्च इमेजिंग दर प्रदान करते हैं, जो मल्टीमॉडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म के थ्रूपुट को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, वर्तमान सेटअप ने 5 सेमी -1 तक वर्णक्रमीय संकल्प के साथ ~ 300 सेमी -1 वर्णक्रमीय सीमा को कवर किया। वर्णक्रमीय सीमा को और बढ़ाने के लिए, हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस माइक्रोस्कोपी22 के लिए व्यापक वर्णक्रमीय बैंडविड्थ के साथ एक संशोधित लेजर प्रणाली को नियोजित किया गया है।

सामूहिक रूप से, यह मल्टीमॉडल और गैर-इनवेसिव इमेजिंग प्लेटफॉर्म नैनोमेडिसिन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और कोशिकाओं, जैविक ऊतकों और नैनोकणों23,24,25 की उच्च सामग्री वाले मल्टीमॉडल आणविक इमेजिंग के लिए एक नया एवेन्यू खोलता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को ईपीएसआरसी अनुदान: रमन नैनोथेरेनोस्टिक्स (ईपी / आर 020965/1) और कंट्रास्ट सुविधा (ईपी / एस 009957/1) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APE SRS Detection Unit APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) APE Lock-in Module Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit Olympus FV 3000 Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm Invitrogen C37483 Polystyrene microspheres
Coverslips Thorlabs CG15CH2 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS Gibco 10500-064 Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview Olympus FV31S-SW Laser scanning microscope control software
Function Generator BX precision 40543 Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles Nanopartz A11-60 Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface Olympus FV30 ANALOG This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3 Newport Spectra-Physics Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame Olympus IX83 Inverted microscope
Mouse 4T1 cells ATCC CRL-2539 Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective Olympus UPLSAPO60XW/IR The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser Nikon CSC1003 Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT Hamamatsu R3896 PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector Hamamatsu C13654-01-Y002 Connector for PMT
Power Supply RS RSPD-3303 C Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640 Gibco A10491-01 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU Newport Spectra Physics SF-TRU System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS

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References

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