Biology

Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704

Charlotte Chambers¹, Linh Quan¹, Grace Yi¹, Aurora Esquela-Kerscher¹

¹Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Este protocolo describe un flujo de trabajo de edición de genes de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas regularmente interespaciadas de alto rendimiento para el análisis de redes de clústeres de microARN que permite la generación rápida de un panel de líneas celulares modificadas genéticamente que llevan combinaciones únicas de eliminación de miembros de grupos de miRNA de hasta 35 kb dentro de un solo experimento.

Abstract

Los microARN (miARN) han surgido como importantes reguladores celulares (supresores de tumores, factores pro-oncogénicos) del cáncer y la metástasis. La mayoría de los estudios publicados se centran en un solo miRNA al caracterizar el papel de los ARN pequeños en el cáncer. Sin embargo, ~ 30% de los genes de miARN humanos están organizados en unidades agrupadas que a menudo se coexpresan, lo que indica un sistema complejo y coordinado de regulación de ARN no codificante. Se requiere una subestimación más clara de cómo las redes agrupadas de miRNA funcionan cooperativamente para regular el crecimiento tumoral, la agresividad al cáncer y la resistencia a los medicamentos antes de traducir los ARN pequeños no codificantes a la clínica.

El uso de un procedimiento de edición de genes mediado por repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas de alto rendimiento y regularmente interespaciadas se ha empleado para estudiar el papel oncogénico de un grupo genómico de siete genes miRNA ubicados dentro de un locus que abarca ~ 35,000 pb de longitud en el contexto del cáncer de próstata. Para este enfoque, las líneas celulares de cáncer humano se infectaron con un vector de lentivirus para la nucleasa Cas9 inducible por doxiciclina (DOX) cultivada en un medio que contiene DOX durante 48 h. Posteriormente, las células fueron co-transfectadas con ARN CRISPR (tracrRNA) transactivante sintético complejado con oligonucleótidos genómicos de ARN CRISPR específicos del sitio (crRNA) para permitir la rápida generación de líneas celulares de cáncer que transportan toda la deleción del grupo de miRNA y deleciones de grupos de genes miRNA individuales o combinadas dentro de un solo experimento.

Las ventajas de este sistema de edición de genes de alto rendimiento son la capacidad de evitar la subclonación de vectores de ADN que consume mucho tiempo, la flexibilidad en la transfección de células con combinaciones únicas de ARN guía en un formato de 24 pocillos y el genotipado de PCR de menor costo utilizando lisados celulares crudos. Los estudios que utilizan este enfoque simplificado prometen descubrir redundancias funcionales e interacciones sinérgicas / antagónicas entre los miembros del grupo de miRNA, lo que ayudará a caracterizar las pequeñas redes complejas de ARN no codificante involucradas en la enfermedad humana e informará mejor el diseño terapéutico futuro.

Introduction

Se necesitan mejores herramientas de investigación para investigar la contribución de los ARN no codificantes en las enfermedades humanas. La desregulación del MiRNA se observa a menudo en trastornos humanos como el cáncer cuando se comparan los perfiles de expresión de estos pequeños ARN no codificantes en los tejidos y fluidos corporales (por ejemplo, sangre, orina) de pacientes con cáncer versus no cáncer, individuos sanos, empleando microarrays, PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y tecnologías de secuenciación profunda de próxima generación ^1,2 . Trabajos recientes han caracterizado un gran subconjunto de estos miRNAs como factores supresores de tumores, oncogénicos y de metástasis que controlan la formación de tumores, la progresión de la enfermedad y la resistencia a los medicamentos. La sobreexpresión experimental y/o la regulación/pérdida a la baja de los miRNAs dan lugar a consecuencias funcionales y pleiotrópicas en la célula, lo que refleja la amplia gama de actividades asociadas al cáncer que estos ARN no codificantes coordinan: crecimiento, apoptosis, diferenciación, remodelación de la cromatina, angiogénesis, transiciones epitelial a mesenquimal (EMT) y MET, metabolismo y respuesta inmune³.

Los MiRNAs se codifican como genes individuales o residen en grupos genómicos, que se transcriben en el núcleo y se procesan ampliamente antes de generar las especies de miRNA de ~22 nucleótidos (nt) de ~22 nucleótidos (nt) biológicamente maduras localizadas en el citoplasma⁴. Estos pequeños ARN ejercen sus efectos post-transcripcionalmente y actúan como reguladores genéticos negativos que se unen a los objetivos de ARN mensajero (ARNm) de una manera específica de la secuencia para llevar el complejo de silenciamiento catalítico inducido por ARN (RISC) al sitio de ARNm, lo que resulta en la degradación de ARNm y / o un bloqueo en la traducción de proteínas. Los MiRNAs son una clase extremadamente abundante de ARN no codificantes en sistemas animales, y existen 2.654 miRNAs maduros en el genoma humano (miRBase release 22.1)⁵. Los MiRNAs suelen asociarse con una complementariedad incompleta con sus dianas de^{ARNm 4}. Por lo tanto, un solo miRNA puede regular decenas a cientos de objetivos distintos de ARNm e impactar funcionalmente en una amplia gama de vías biológicas. Para aumentar la complejidad de los mecanismos basados en miRNA, un solo ARNm puede ser regulado por múltiples miRNAs distintos. Por lo tanto, es un desafío investigar cómo la desregulación de miRNA interrumpe el equilibrio homeostático del cuerpo y conduce a la malignidad humana.

La mayoría de los estudios publicados se han centrado en un solo miRNA al caracterizar su papel en los eventos de la enfermedad. Sin embargo, ~ 30% de los genes de miARN humanos están organizados en unidades agrupadas (típicamente ~ 10 kilobases [kb]) que a menudo se transcriben en la misma orientación y se coexpresan, lo que indica un sistema coordinado y complejo de regulación de ARN no codificante⁶. El grupo de miARN humano policistrónico más grande es el grupo 14q32 que comprende 54 precursores de miARN. Una de las unidades de miARN agrupadas más estudiadas asociadas con los cánceres humanos es el grupo policistrónico miR-17-92 compuesto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 y miR-92-1 que residen dentro del intrón 3 del ARN no codificante, c13orf25. El grupo miR-17-92 se amplifica con frecuencia en neoplasias malignas hematopoyéticas y se sobreexpresa en tumores sólidos y ha establecido funciones oncogénicas en la promoción de la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la angiogénesis⁷. Además, el grupo supresor de tumores miR-15a y miR-16-1 ubicado dentro del intrón del gen no codificante Leu2 a menudo se elimina en leucemias y se regula a la baja en una amplia gama de cánceres, funcionando para bloquear el crecimiento tumoral dirigiéndose al gen antiapoptótico BCL2 y genes adicionales de progresión del ciclo celular⁸. El grupo miR-888 está elevado en pacientes con cáncer de próstata de alto grado y consta de siete genes miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b y -891a) localizados en el cromosoma humano Xq27.3 ^9,10.

El grupo miR-888 se mapea dentro del locus HPCX1 (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1) que abarca Xq27-2, que se identificó mediante el análisis de vinculación de pedigríes familiares de cáncer de próstata hereditario 11,12,13,14,15,29. La caracterización funcional de los miembros agrupados individuales de miR-888 utilizando herramientas convencionales de expresión errónea de miRNA (imitadores de miRNA e inhibidores antisentido) indicó que estos miRNAs desempeñan funciones superpuestas en la regulación del crecimiento y la invasión del tumor de próstata ^9,10. Sin embargo, estos métodos experimentales no se prestan fácilmente para estudiar cómo múltiples miembros agrupados de miR-888 actúan sinérgica o antagónicamente en una red de ARN no codificante para controlar la homeostasis tisular y la progresión del cáncer. Este protocolo simplificado descrito utilizando la tecnología de edición de genes CRISPR de alto rendimiento se modifica para diseccionar molecularmente los grupos de miRNA asociados con cánceres humanos (por ejemplo, el grupo miR-888) para cerrar esta brecha de conocimiento.

Los genes crispr bacteriano y crispr asociado (cas) median la inmunidad adaptativa contra bacteriófagos¹⁶. El descubrimiento de este antiguo sistema de vigilancia procariota se adaptó rápidamente como una herramienta científica eficiente para atacar fácilmente cualquier locus genómico deseado y realizar alteraciones en la secuencia de ADN dentro de una amplia gama de sistemas animales y tipos de células, tanto in vitro como in vivo^16,17. Esta técnica es muy prometedora como un método eficaz para interrogar las redes de miRNA en el contexto de la enfermedad humana. Con este fin, este protocolo de edición de genes CRISPR de alto rendimiento para estudiar el grupo miR-888 que abarca ~ 35 kb en el cromosoma X humano en líneas celulares de cáncer de próstata humano inmortalizadas (LNCaP, PC3-ML) se construye para interrogar cómo los miembros del grupo coordinan las vías de progresión del cáncer. Este enfoque se puede aplicar a la caracterización de cualquier grupo de miRNA y permite a los investigadores generar rápidamente líneas celulares humanas que transportan toda la deleción del grupo de miRNA y las deleciones de grupos de genes de miRNA individuales y combinadas dentro de un solo experimento.

En este procedimiento, se establecen líneas celulares estables que llevan un sistema de expresión lentiviral inducible por doxiciclina (DOX) que permite al investigador controlar la expresión del gen endonucleasa Asociada a Streptococcus pyogenes CRISPR Cas9 (csn1) a través del promotor constitutivo INDUCIBLE POR DOX TRE3G. El sistema bipartito Tet-On 3G implica un promotor constitutivo del factor de elongación humana 1 alfa (hEF1alpha) para impulsar la transcripción tanto del gen Tet-On 3G como del gen de resistencia a la blasticidina (Blast^R) como una transcripción bicistrónica. La proteína transactivadora Tet-On 3G solo se une al promotor TRE3G en presencia de DOX, lo que resulta en una transcripción Robusta de Cas9. En ausencia de DOX, no hay o hay una expresión basal de Cas9 muy mínima. Por lo tanto, el investigador puede inducir una alta producción de proteína Cas9 en células cultivadas en medios suplementados con DOX durante los pasos de edición del gen CRISPR y controlar el aclaramiento rápido de la proteína CAS9 tras la retirada de DOX.

Este protocolo también describe el diseño de oligonucleótidos sintéticos de ARN CRISPR (arncr) dirigidos a regiones que flanquean todo el grupo de miARN, regiones individuales de horquilla de miARN (premiRNA) y / o subconjuntos de genes de miARN dentro del grupo. Cada CRRNA diseñado contiene una secuencia guía única de 5'-terminal de 20 nt (complementaria a la secuencia genómica de interés a dirigir), seguida de una secuencia de repetición invariante de 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') que permite el emparejamiento de bases con los oligonucleótidos universales de ARN CRISPR (tracrRNA)¹⁸. Juntos, el crRNA recocido y el tracrRNA (relación mixta 1:1) funcionan como el ARN guía para este protocolo (Figura 1A). En cada experimento, dos ARN guía sintéticos se transfectan en células inducidas por DOX para asociar y escoltar la proteína Cas9 bacteriana a los sitios de ADN genómico (5' y 3') que flanquean la región del grupo de miRNA objetivo de eliminación (Figura 1B).

Una secuencia de motivos adyacentes protoespaciadores (PAM) (5'-NGG-3' para el tipo salvaje S. pyogenes Cas9) debe estar presente en el genoma celular y ubicarse inmediatamente adyacente a la secuencia de ADN de 20 nt a la que se dirige el ARN guía¹⁷. La secuencia PAM sirve como una señal de unión y posiciona la región catalítica de la enzima endonucleasa Cas9 en el sitio de ADN genómico objetivo, lo que posteriormente conduce a una escisión de ADN dirigida de doble cadena (ds) ubicada ~ 3 nt aguas arriba de la PAM. La maquinaria de reparación del ADN de la célula repara los extremos del ADN escindido, lo que puede resultar en una ligadura perfecta, pero a menudo se produce una unión final no homóloga (NHEJ), causando pequeñas inserciones o deleciones (indels) en el sitio de reparación. Dado que los miRNAs son genes no codificantes que a menudo se encuentran dentro de regiones intergénicas e intrónicas, estos indels conllevan un bajo riesgo de crear mutaciones no deseadas sin sentido / sin sentido.

Al emplear oligonucleótidos de ARN sintéticos (ARNcr recocido y ARNtra, relación molar 1:1) que codifican para el complejo de ARN guía en estos experimentos, esta estrategia de eliminación de genes evita la subclonación de vectores de ADN que consume mucho tiempo y permite una gran flexibilidad para transfectar combinaciones únicas de ARN guía a las células en un formato de 24 pocillos. La preparación de lisados celulares crudos para la detección de genotipos de PCR también evita métodos de purificación de ADN costosos y lentos, al tiempo que permite la generación simplificada de líneas celulares de una sola colonia y el análisis fenotípico. De hecho, este protocolo de edición de genes CRISPR de alto rendimiento se ha utilizado con éxito para transfectar líneas celulares de cáncer de próstata cultivadas (LNCaP, PC3-ML) con 32 combinaciones únicas de ARN guía en un solo experimento y generar líneas eliminatorias que llevan deleciones para toda la región del grupo miR-888 de ~ 35 kb; combinaciones de deleción más pequeñas para los miembros del grupo miR-888 pertenecientes a las familias miR-743 y miR-891a; así como deleciones para miembros individuales de miRNA dentro del grupo miR-888. Estudios como estos proporcionarán una subestimación más clara de cómo los miRNAs agrupados funcionan cooperativamente para regular el crecimiento tumoral, la agresividad y la resistencia a los medicamentos antes de traducir los miRNAs a la clínica como herramientas terapéuticas y de diagnóstico.

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Protocol

1. Preparación para la edición de genes CRISPR y diseño de ARN guía para generar líneas celulares knockout de grupos de miRNA

Cree un archivo de ADN que contenga la secuencia genómica completa de la región del grupo de miRNA de interés (intergénica, intrónica) y al menos 1 kB de las regiones genómicas circundantes utilizando un programa de software de anotación de secuencia^{de ADN 19}.
1. Utilice una herramienta de edición de características en el archivo de ADN creado para marcar el locus del cúmulo de miRNA objetivo (intergénico, intrónico) y cada secuencia de horquilla de miRNA individual que pertenezca al grupo de miRNA, así como anotar otros genes codificantes y no codificantes cercanos y / o características reguladoras ^5,20,21,22.
2. Asegúrese de que las regiones de miRNA a las que se dirige la deleción no interrumpan inadvertidamente los genes codificantes de proteínas cercanos, los genes no codificantes o los elementos reguladores importantes del ADN.
  NOTA: Considere la complejidad genómica (por ejemplo, duplicaciones/fusiones cromosómicas) de la línea celular utilizada en este protocolo.
Diseñar crRNAs sintéticos dirigidos a 20 nt de secuencia de ADN genómico que flanquea todo el grupo de miRNA, regiones individuales de horquilla de miRNA (pre-miRNA) y / o subconjuntos de genes de miRNA dentro del grupo utilizando una herramienta de software de diseño de ARN de guía bioinformática (por ejemplo,²³). Asegúrese de que la enzima Cas9 adecuada esté anotada en la herramienta de diseño de ARN guía (es decir, S. pyogenes Cas9).
NOTA: El ARNcr sintetizado contendrá esta secuencia guía única de 5'-terminal de 20 nt (complementaria al objetivo de ADN) seguida de un invariante de 22 nt S. pyogenes repetir secuencia para permitir el emparejamiento de bases con el oligonucleótido de ARNtra universal sintetizado. Recocidos juntos, funcionarán como el ARN guía en este protocolo.
1. Haciendo referencia al archivo de ADN creado (Paso 1.1.), ingrese ~ 150 nt de secuencia de ADN que reside inmediatamente aguas arriba (5') o aguas abajo (3') del locus de horquilla / clúster de miRNA destinado a la eliminación en la herramienta de software de diseño de ARN de guía bioinformática²³.
  NOTA: La herramienta de diseño identificará secuencias únicas de 20 nt para el diseño de oligonucleótidos de ARNcr que residen inmediatamente adyacentes a la secuencia PAM (en la cadena de ADN no dirigida) (por ejemplo, S. pyogenes Cas9 PAM secuencia NGG). A continuación se proporciona un ejemplo de diseño de ARNcr dirigido a un sitio inmediatamente aguas arriba (5') del locus del gen mir-891a (específicamente 5A (891a) discutido en la sección de resultados representativos y la Tabla 1).
  1. Abra la herramienta de software de diseño de ARN guía²³.
  2. Escriba el nombre 5A(891a) en la ventana Introducir nombre .
  3. En la ventana Introducir una secuencia de ADN , introduzca 150 nt de secuencia genómica que residen inmediatamente aguas arriba (5') del gen precursor mir-891a : 5'-AAGAAAATACATGCTGATAGTTACACAGG
    TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
    TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
    ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
    CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
  4. Marque la casilla Habilitar comprobación de especificidad para excluir los sitios fuera de destino detectados computacionalmente por el programa. Elija el organismo apropiado (es decir, humano [Homo sapiens]).
  5. Especifique la enzima Cas9 PAM correcta empleada para los estudios, en este caso, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, para generar la siguiente configuración predeterminada: PAM relativa al objetivo: Después; Repetir secuencia: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Relativo a la guía: 3; Longitud de la secuencia objetivo: 20; Corte en relación con el objetivo 5' inicio: Sentido 17 Anti-sentido 17.
  6. Haga clic en el botón Siguiente para ver los resultados de la síntesis sintética de crRNA.
    NOTA: En este ejemplo, el crRNA sugerido a sintetizar reconocerá el objetivo de ADN ATACATGCTGATAGTTACAC y se ubicará adyacente a PAM:AGG.
2. Haga referencia al archivo de ADN (creado en el paso 1.1.) para determinar las mejores secuencias diana de CRRNA 20 NT candidatas que residen más cerca del locus de miRNA que se eliminará y poseen la mayor especificidad para el objetivo genómico previsto.
  1. Utilice herramientas de análisis computacional fuera de la orientación para evaluar la especificidad del ARNcr candidato y predecir posibles sitios fuera de la orientación en loci genómicos no relacionados con la región de interés del grupo de miRNA objetivo (por ejemplo, 24,25,26,27).
  2. Registre los posibles resultados fuera del objetivo para su posterior referencia al genotipar líneas celulares clonales CRISPR de una sola colonia mediante PCR (Paso 4.2.6.).
    NOTA: El grado de complementariedad de la secuencia compartida entre el oligonucleótido de ARNcr diseñado y la secuencia diana genómica dictará qué tan selectivamente la enzima Cas9 escinde el genoma en ese locus. Dado que el ARN guía se redirige al objetivo genómico en una dirección de 3' a 5', los desajustes en el extremo 5' de la secuencia diana de ADN (las primeras 8-10 bases) a menudo bloquearán la escisión mediada por Cas9. Si la secuencia diana genómica comparte homología con otro locus genómico, excepto dentro de las primeras ocho bases de la secuencia de ADN, se predice que este ARN guía tiene una baja probabilidad de desobjecimiento en este sitio.
  3. Diseñe cuatro CRRNA únicos para cada locus de miRNA dirigido: dos crRNAs diseñados para dirigirse a secuencias de ADN complementarias inmediatamente 5' de la horquilla/grupo de miRNA (5'A, 5'B) y dos crRNAs diseñados para apuntar a secuencias de ADN complementarias inmediatamente 3' de la horquilla/cluster de miRNA (3'A, 3'B).
    NOTA: Al realizar las transfecciones CRISPR (en la Sección 3), se probarán cuatro posibles combinaciones de pares de ARN guía de 5' y 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) para cada locus de miRNA dirigido para aumentar la probabilidad de generar deleciones exitosas de locus de miRNA en un solo experimento.
  4. Utilice una herramienta de edición de características en el archivo de ADN creado (Paso 1.1.) para marcar la secuencia objetivo de ADN (con PAM adyacente) para cada CRRNA diseñado que se va a sintetizar.
Diseñar y sintetizar cebadores de PCR (hacia adelante, hacia atrás) que flanqueen las regiones de clúster de miRNA objetivo para genotipar líneas celulares CRISPR (y etiquetar los cebadores en el archivo de ADN creado).
1. Para el genotipado de líneas celulares que transportan pequeñas deleciones genómicas para miRNAs estrechamente agrupados o individuales, diseñe cebadores de PCR (hacia adelante, hacia atrás) que residan aproximadamente 150 pb a cada lado del sitio de escisión Cas9 / región de knockout que permitirán la detección de fragmentos de ADN de tipo salvaje (~ 600 pb) y knockout (~ 300 pb) en una sola reacción de PCR a través de electroforesis en gel.
2. Para genotipar líneas celulares que llevan grandes deleciones genómicas para combinaciones de precursores de miRNA o todo el grupo de miRNA, nuevamente diseñe cebadores de PCR (hacia adelante, hacia atrás) que residan aproximadamente 150 pb a cada lado del sitio de escisión / knockout de Cas9. Tenga en cuenta que, si la deleción del grupo de miRNA dirigida abarca >4 kb de longitud, la reacción de PCR probablemente solo detectará el fragmento de ADN knockout más pequeño (~ 300 pb), pero no el fragmento de ADN de tipo salvaje. Por lo tanto, diseñe cebadores de PCR adicionales (hacia adelante, hacia atrás) que puedan detectar la presencia o ausencia de genes internos del grupo de miRNA para ayudar al proceso de detección y validar las líneas celulares knockout homocigotas.

2. Generación de líneas celulares lentivirales estables que llevan el casete de expresión Cas9 inducible por DOX

NOTA: Realice todo el trabajo de cultivo celular y virus en una campana de bioseguridad certificada utilizando procedimientos BSL2 y técnica aséptica.

Determinar el tipo de línea celular apropiado para los estudios CRISPR y los medios de crecimiento preferidos.
NOTA: Este protocolo fue desarrollado para las líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP (medio preferido: RPMI, 10% de suero fetal bovino [FBS]) y PC3-ML (medio preferido: DMEM, 10% FBS).
Realizar una curva de "muerte" de blasticidina para determinar la concentración óptima del fármaco para seleccionar las células infectadas por lentivirus que portan el cassette del gen de resistencia a la blasticidina (Paso 2.3.).
1. Placa de células en 11 pocillos de una placa de 24 pocillos y crecen a 37 °C, 5% DE CO₂ en el medio preferido hasta aproximadamente un 75% de confluente.
2. Diluir la blasticidina (material de trabajo 1 mg/ml) en el medio preferido con una concentración final que oscile entre 0, 1 y 10 μg/ml y diluirla en incrementos de 1 μg/ml.
3. Etiquete los pocillos de la placa de 24 pocillos sembrados del 1 al 11. Retire el medio de crecimiento de los pozos y reemplácelo con las concentraciones apropiadas de blasticidina.
4. Cambie el medio con las concentraciones apropiadas de blasticidina cada dos días durante 7-10 días.
5. Examine las células diariamente durante el curso de tiempo y determine la concentración mínima de blasticidina requerida para matar todas las células dentro de 5-7 días.
  NOTA: Se deberá realizar una curva de "muerte" de blasticidina para cada línea celular específica empleada para los experimentos de edición de genes CRISPR.
Infectar las células con lentivirus portadores del casete de expresión Cas9 inducible por DOX y realizar la selección de blasticidina utilizando la concentración óptima determinada en el Paso 2.2.
1. En tres pocillos de una placa de 6 pocillos, sembra 5 × 10⁴ células por pozo y crece en el medio preferido a 37 °C, 5% CO₂ durante la noche (ON).
2. Al día siguiente, descongele el vector de expresión de lentivirus para Cas9 inducible por DOX (Lenti-iCas9) en hielo. Mezcle suavemente (no vórtice las partículas del virus).
  NOTA: Guarde el lentivirus en alícuotas a -80 °C para evitar múltiples ciclos de congelación/descongelación, lo que disminuirá los títulos virales y la eficiencia de la infección.
3. Calcular el volumen necesario para transducir 5 × 10⁴ células con virus a una multiplicidad de infección de 0,3 (MOI = 0,3) en función de la concentración del título viral.
4. Pipetear el volumen apropiado del virus en 250 μL (por pocillo) de medio preferido libre de suero y antibiótico suplementado con bromuro de hexadimetrina de 0,8 μg/ml. Mezclar suavemente.
  NOTA: El bromuro de hexadimethrine es un polímero catiónico que se encuentra para aumentar la adsorción viral y la eficiencia de la infección.
5. Retire el medio. Añadir los 250 μL de medio de transducción preparado con el virus Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) a las células e incubar ON a 37 °C, 5% CO₂. (Acorte el tiempo de incubación a 4-6 h si las células exhiben efectos tóxicos relacionados con el virus).
6. Reemplace el medio con el medio preferido fresco y permita que las células se recuperen durante 1-2 días.
7. Realice la selección de blasticidina en las células infectadas durante 10-14 días utilizando la concentración óptima de blasticidina derivada de la curva de "muerte" descrita en el Paso 2.2.
  1. Paralelamente, cultivar las células no infectadas en medio con la concentración óptima de blasticidina para ser utilizadas como control positivo para la selección viral.
8. Cambie el medio suplementado con la concentración óptima de blasticidina cada 3 días durante el curso de tiempo de selección para eliminar las células muertas.
  NOTA: Sólo las células que sobrevivan a la selección de blasticidina habrán integrado el vector lentiviral.
9. Expanda las líneas celulares Lenti-iCas9 seleccionadas con blasticidina.
  NOTA: Registre el número de paso de celda en cada expansión.
  1. Congele una porción de las células Lenti-iCas9 en el medio preferido suplementado con sulfóxido de dimetilo al 10% (DMSO) para el almacenamiento criovial a largo plazo.
  2. Analizar una porción de las células Lenti-iCas9 por western blot⁹ para identificar la línea celular que exhibe los niveles más robustos de proteína Cas9 inducible por DOX (ver Paso 2.3.).
Realizar una curva de concentración de doxiciclina en líneas celulares Lenti-iCas9 recién establecidas para determinar las condiciones óptimas para la inducción de la proteína Cas9.
1. Configure cuatro placas independientes de 6 pocillos para cada línea celular probada para realizar este curso de tiempo de concentración DOX. Placa 5 × 10⁴ células por pocillo de cada placa de 6 pocillos y crecen a 37 °C, 5% CO₂ en el medio preferido durante 24 h.
2. Diluir DOX (material de trabajo 1 mg/ml) en el medio preferido con una curva de concentración de DOX final que oscila entre 0, 50, 100, 150, 250 a 500 ng/mL.
3. Etiquete los pocillos de cada placa de 6 pocillos sembrados del 1 al 6. Retire el medio y reemplácelo con las concentraciones dox apropiadas. Cultivar placas 1-4 hasta los siguientes puntos de tiempo: 24 h, 48 h y 72 h de inducción DOX; y 120 h después de la retirada de DOX (inicialmente inducida por DOX de 72 h).
4. Cosechar los pocillos de la placa en cada punto de tiempo utilizando métodos apropiados (por ejemplo, tripsinización). Almacene los gránulos celulares a -80 °C. Procese los gránulos celulares en tampón RIPA para el aislamiento de lisado y el análisis de western blot Cas9.
  1. Ejecute 40 μg de lisado celular para cada muestra del curso de tiempo de inducción DOX utilizando un gel Bis-Tris desnaturalizante al 4% -12% y transfiera las proteínas a una membrana inmunoblot.
  2. Hibridar la membrana inmunoblot con un anticuerpo primario contra Cas9 para detectar la proteína de 160 kDa. Normalice los niveles de Cas9 utilizando un gen de limpieza como GAPDH (37 kDa).
5. Sobre la base de los resultados de Western Blot, determinar la concentración óptima de DOX para inducir Cas9 en las líneas celulares Lenti-iCas9.
  NOTA: Este curso de tiempo también revelará cuán estrictamente se regula la expresión de Cas9 después de la eliminación de DOX 120 h.
6. Establecer colonias unicelulares para las líneas celulares Lenti-iCas9 que muestren una expresión robusta de la proteína Cas9 para optimizar las transfecciones CRISPR (en la Sección 3).

3. Realización de reacciones CRISPR mediante inducción Cas9 y transfección de ARN guía sintética de células utilizando un formato de alto rendimiento

NOTA: En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo de trabajo.

En el papel, mapee las combinaciones de pares de crRNA que se transfectarán en cada pocillo de una placa de 24 pocillos dirigida a todo el grupo de miRNA, varias combinaciones de genes de miRNA agrupados, así como miembros individuales del grupo de miRNA.
1. En el mapa, etiquete cuatro pozos por locus de miRNA objetivo. Haga que cada uno represente bien una reacción de transfección, con dos arncr únicos colocados a 5' y 3' del locus genómico knockout de miRNA deseado y el tracrRNA (relación molar recocida 1: 1).
2. Asegúrese de que cada uno de los cuatro pocillos etiquetados represente un par único de ARNcr para la transfección (por ejemplo, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
  NOTA: El diseño de dos crRNAs de 5' y dos crRNAs de 3' flanqueando cada locus de miRNA dirigido (Sección 1) permite la generación de cuatro posibles pares de ARN guía de 5' y 3' en la reacción de transfección.
Coloque la línea celular Lenti-iCas9 en 5 x 10⁴ celdas/pocillo de una placa de 24 pocillos en el medio preferido que contenga la concentración doX optimizada (determinada en el paso 2.4.). Cultive las células durante 24-48 h a 37 °C, 5% CO₂ para inducir la expresión de la proteína Cas9.
Transfecta las células Lenti-iCas9 con los ARN guía preparados de 5' y 3'.
1. Reconstituir los oligonucleótidos sintetizados de arncr y arhorrRNA con agua libre de nucleasa a una concentración de stock de 10 μM. Almacenar a -80 °C a largo plazo.
2. Etiquete cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml por locus de miRNA objetivo basado en el mapa experimental diseñado en el Paso 3.1., que representa las cuatro combinaciones posibles de pares de arNcr de 5' y 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
3. En cada tubo, mezcle una relación molar de 1:1 de ARNtracr y arNcr únicos (5' y 3') para formar el complejo de ARN guía de 2 μM utilizando la siguiente reacción (volumen final de 10 μL):
  1. Añadir 2,5 μL de artrantr (stock de 10 μM), 1,25 μL del crRNA posicionado 5' (stock de 10 μM), 1,25 μL del crRNA posicionado 3' (stock de 10 μM) y 5 μL de 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 a un tubo centrífugo de 1,5 mL. Microcentrífuga para 30 s a 16.000 × g para mezclar. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
4. A cada tubo, agregue 40 μL de medio sérico reducido (por ejemplo, Opti-MEM) a los 10 μL de reacción del complejo de ARN guía (volumen total de 50 μL). Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
5. En un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml, mezcle 2 μL del reactivo de transfección²⁸ (véase NOTA 3.3.5.1.) y 48 μL de medio sérico reducido (por ejemplo, Opti-MEM, volumen final de 50 μL) suavemente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Incubar en RT durante 5 min.
  1. Prepare una mezcla maestra del reactivo de transfección multiplicando las cantidades de reactivo (2 μL) y medio sérico reducido (por ejemplo, Opti-MEM, 48 μL) por el número de pocillos a transfectar, más un 10% de volumen adicional para tener en cuenta las ligeras imprecisiones de pipeteo.
    NOTA: Seleccione un reactivo de transfección que esté optimizado para transfecciones de oligonucleótidos de ARN pequeño y ARN CRISPR, así como para la línea celular tipo²⁸.
6. A cada tubo que contenga los 50 μL de mezcla de ARN guía (de la etapa 3.3.4.), añádase los 50 μL del reactivo de transfección diluido (de la etapa 3.3.5.). Pipetee la mezcla lentamente hacia arriba y hacia abajo una vez para mezclar. Incubar en RT durante 20 min.
7. Añadir 400 μL de medio libre de antibióticos suplementado con DOX (concentración óptima) a cada tubo que contenga los 100 μL de la mezcla guía de ARN/transfección. Pipetear suavemente para mezclar.
Retire el medio de las células Lenti-iCas9 inducidas por DOX (paso 3.2.). Añadir 500 μL de mezcla media/DOX/ARN guía/transfección basada en el mapa experimental de placas de 24 pocillos (Paso 3.1.). Incubar las células transfectadas durante 48 h a 37 °C, 5% CO₂.
Reemplace el medio con el medio fresco preferido sin DOX (para eliminar la proteína Cas9 de las células). Permita que las células se recuperen durante otras 24-48 h a 37 °C, 5% CO₂.
Cosechar las células transfectadas (tripsinización) y prepararse para el genotipado y las diluciones unicelulares.
NOTA: Las células representan una población mixta que contiene células transfectadas editadas por genes CRISPR y no transfectadas de tipo salvaje. Este paso determinará la eficiencia de la edición CRISPR antes de invertir tiempo / recursos en la expansión de colonias de una sola célula.
1. Lave las células 1x con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Incubar las células en 100 μL de tripsina durante 5 min a 37 °C, 5% CO₂ y transferir las células a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml que contenga 1 ml de medio.
2. Invierta para mezclar y microcentrífugo las células durante 5 min a 200 × g a 20 °C. Retire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de PBS.
3. Microcentrífugo de las células lavadas durante 5 min a 200 × g a 20 °C. Retire el PBS y vuelva a suspender el pellet celular en 150 μL del medio preferido.
Determine el número de células por microlitro de los 150 μL de células resuspendidas utilizando un hemocitómetro o un instrumento automatizado de conteo de células.
Separe los 150 μL de células resuspendidas en tres partes.
1. Congelar 1/3 de células transfectadas (50 μL) en medio más 10% de DMSO (volumen final de 150 μL) en crioviales para futuras expansiones/almacenamiento a largo plazo.
2. Transfiera 1/3 de las células transfectadas (50 μL) a un tubo pcr limpio de 0,2 ml para el genotipado.
  1. Microcentrífugo las células durante 5 min a 200 × g a 4 °C y retira el medio.
  2. Resuspend el pellet celular en 100 μL de PBS.
  3. Microcentrífugo las células durante 5 min a 200 × g a 4 °C y retire el PBS. Almacene los pellets de células de población mixta a largo plazo a -80 °C.
  4. Procese el pellet de celda para el genotipado utilizando el flujo de trabajo de la Sección 4.
3. Preparar el 1/3 final de las células (50 μL) para dilución y chapado en un formato de placa de 96 pocillos para generar colonias de una sola célula.
  1. Sobre la base del recuento de células en el Paso 3.7., calcule las diluciones requeridas para lograr 10, 5, 2 y 1 celda (s) en 100 μL de medio por pocillo de una placa de 96 pocillos.
  2. Usando un multipipeteador de 12 canales y un depósito de reactivo estéril, agregue 100 μL de células diluidas por pozo a dos filas de la placa (24 pocillos en total) por cada dilución (10, 5, 2 o 1 celda por pozo). Espere de 4 a 6 semanas para que las células crezcan hasta la confluencia para la expansión de colonias unicelulares. Observe las células semanalmente bajo un microscopio de luz y observe si las colonias representan colonias de una o varias células.
  3. Recolectar ~10-15 colonias unicelulares para genotipado (Sección 4). Identifique al menos tres líneas de colonias independientes, knockout y unicelulares para cada locus de miRNA dirigido. Conserve las líneas de una sola celda de tipo salvaje como controles.
    NOTA: El número de exámenes dependerá del tipo de línea celular y del impacto del fenotipo de eliminación de miARN en el crecimiento/viabilidad celular.

4. Genotipado por PCR de líneas celulares CRISPR utilizando lisados celulares crudos

Cosecha colonias individuales de una sola célula de pozos casi confluentes de una placa de 96 pocillos.
NOTA: La eliminación del medio/PBS descrita en estos pasos se puede realizar manualmente utilizando un aspirador de vacío en el gabinete de bioseguridad, pero tenga cuidado de evitar la contaminación cruzada. Use una nueva punta de tubería "amarilla" estéril de 200 μL para cada pozo de la placa de 96 pocillos al aspirar, en la que cada punta amarilla intercambiada se coloca firmemente al final de una pipeta de pasto de vidrio estéril unida al aspirador de vacío.
1. Lavar los pocillos 1x con 100 μL de PBS. Aspirar el PBS.
2. Añadir 50 μL de tripsina e incubar durante 2-5 min a 37 °C, 5% CO₂.
3. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y transfiera las células resuspendidas a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 1 ml de medio.
4. Invierta para mezclar y ginete suavemente las células en una microcentrífuga durante 5 min a 200 × g a 20 °C.
5. Retire el medio y agregue 1 ml de PBS. Mueva suavemente el tubo para interrumpir el pellet e invierta varias veces para mezclar.
6. Microcentrífuga durante 5 min a 200 × g a 20 °C para granular las células.
7. Retire el PBS y vuelva a suspender el pellet en 300 μL de PBS fresco.
8. Divida la muestra de 300 μL en dos partes.
  1. Transfiera 200 μL de las células (2/3 del pellet) a un pozo de una placa de 24 pocillos que contenga 1 ml del medio preferido. Una vez validado el genotipo, utilice estas células para expandir las líneas celulares knockout mediadas por CRISPR para el análisis funcional.
  2. Transfiera 100 μL de las células (1/3 del pellet) a un tubo de PCR de 0,2 ml. Microcentrífuga durante 5 min a 3.000 x g a 4 °C. Retire el PBS. Conservar el pellet a -80 °C.
Preparar lisados de células crudas para el genotipado y el análisis de secuencia utilizando los cebadores de PCR diseñados en el paso 1.3. Incluya los lisados celulares preparados a partir de células no transfectadas en estos experimentos para usarlos como controles positivos de tipo salvaje.
1. Resuspender el pellet celular en 4 μL de tampón de 5x ADN polimerasa (ver la Tabla de Materiales, concentración final 1x), 1 μL de Proteinasa K (20 ng/mL de stock), 1 μL de RNasa A (10 ng/mL de stock) y agua libre de nucleasa hasta un volumen total de 20 μL.
2. Lisar las células en un termociclador utilizando un programa de PCR: 56 °C durante 30 min y 96 °C durante 5 min. Conservar los lisados celulares a -20 °C.
3. Realizar una reacción de PCR utilizando los cebadores de PCR diseñados (adelante, atrás) que flanquean el ARN guía 5' y 3' guía de los sitios dirigidos al ARN (Tabla 1).
  NOTA: Las condiciones del tampón y termociclador de la ADN polimerasa dependerán de la enzima ADN polimerasa Taq utilizada para la reacción de PCR. Este protocolo fue optimizado para una Phusion HF DNA Polimerasa.
  1. Configure la mezcla de reacción de PCR en hielo: 5 μL de tampón de ADN polimerasa 5x, 0,5 μL de imprimación de PCR hacia adelante (stock de 10 μM), 0,5 μL de imprimación de PCR inversa (10 μM de stock), 0,5 μL de 10 mM de dNTP, 0,25 μL de ADN polimerasa, 1-4 μL de lisado celular y agua libre de nucleasa hasta un volumen total de 25 μL.
  2. Ejecute la reacción de PCR en un termociclador utilizando el programa: 98 °C durante 3 min, y 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 62 °C durante 15 s, 72 °C durante 15 s y luego 72 °C durante 10 min. Mantener durante 4 °C. Véase la NOTA 4.2.3. encima.
4. Cargue los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% para el análisis de electroforesis.
5. Extraer ADN de los fragmentos aislados de PCR del tamaño molecular previsto para los genotipos knockout (y de tipo salvaje). Prepare las muestras para la secuenciación del ADN.
6. Validar que la reacción CRISPR fue exitosa y realizar la secuenciación de ADN de los fragmentos aislados de PCR para identificar el sitio de escisión cas9 y confirmar la deleción del locus miRNA.
  1. Aísle al menos tres líneas celulares knockout independientes para cada locus de miRNA dirigido por CRISPR. Conservar líneas celulares de tipo salvaje (y heterocigotas) para usarlas como controles en estudios funcionales posteriores.
  2. Realizar análisis qRT-PCR o northern blot para confirmar que las líneas celulares knockout no expresan miRNA maduro para el locus eliminado.
    NOTA: La secuenciación del genoma completo (WGS) es el método más definitivo para validar la edición de genes CRISPR y la derivación.
  3. Prueba de efectos CRISPR fuera de la orientación mediante PCR, que se predijeron computacionalmente (Paso 1.2.3). 24,25,26,27.
  4. Si el cribado extensivo de colonias unicelulares solo da como resultado genotipos heterocigotos, repita la transfección de ARN guía en las líneas heterocigotas unicelulares.
    NOTA: La incapacidad de obtener líneas celulares homocigotas knockout podría indicar efectos letales debido a la pérdida de miRNA o la complejidad genómica inherente (por ejemplo, duplicaciones / fusiones cromosómicas) de la línea celular parental que requieren un análisis más detallado.

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Representative Results

Este protocolo de deleción CRISPR de alto rendimiento se empleó con éxito utilizando la transfección de líneas celulares de cáncer humano LNCaP e PC3-ML inducibles por Cas9 con ARN guía de oligonucleótidos sintéticos dirigidos al grupo miR-888, que se estudiaron en el contexto del cáncer de próstata. El grupo miR-888 se identificó inicialmente en una prueba de perfil de expresión como elevado en pacientes con cáncer de próstata con enfermedad de alto grado en comparación con pacientes de bajo grado y no^cancerosos ^9,10. El grupo miR-888, que abarca 35.124 pb, consta de siete miRNAs (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b y -891a) en el cromosoma humano Xq27.3 (Figura 2A). Este locus se encuentra dentro del HPCX1 (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1, Xq27-28), que se asocia con el cáncer de próstata hereditario 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b y -892c comparten homología de secuencia y pertenecen a la familia miR-743 conservada por mamíferos. Los miembros del grupo miR-891a y miR-891b solo comparten homología de secuencia entre sí y pertenecen a la familia miR-891 específica de los primates. La organización genómica del cúmulo miR-888 se conserva a través de primates, lo que implica la conservación funcional de una importante red de señalización³⁰.

Trabajos previos que utilizaron estudios experimentales de sobreexpresión (imitadores de miRNA) e inhibición (oligonucleótidos antisentido) para evaluar la actividad individual de los miembros del grupo miR-888 revelaron un papel superpuesto para todos los miembros del grupo miR-888 para promover la invasividad de las células de cáncer de próstata utilizando ensayos de cámara matrigel Boyden ^9,10. En particular, miR-888 y miR-891a funcionaron de manera similar para inducir el crecimiento de células prostáticas (ensayos WST-1), acelerar la carga tumoral de próstata en xenoinjertos de ratón y regular objetivos comunes (por ejemplo, TIMP-2)^9,10. Sin embargo, este trabajo sugirió una interacción más compleja entre los miembros del clúster miR-888. Por ejemplo, miR-888 y miR-891a mostraron efectos sinérgicos en la promoción de la proliferación de células prostáticas PC3-N, mientras que tanto miR-890 como miR-892c mostraron efectos inhibitorios del crecimiento utilizando ensayos WST-1⁹. Por lo tanto, este protocolo CRISPR de alto rendimiento se empleó para interrogar genéticamente la red de clústeres miR-888 en el contexto del cáncer de próstata.

El flujo de trabajo descrito para la edición de genes CRISPR Cas9 (Figura 1) permitió probar 32 reacciones únicas de transfección de ARN guía CRISPR en un solo experimento utilizando un formato de 24 pocillos. Este protocolo resultó en la identificación exitosa de un panel de líneas celulares knockout de cáncer de próstata humano que transportan deleciones para todo el grupo miR-888, combinaciones específicas de miembros del grupo miRNA y miembros individuales de miRNA. Se estableció por primera vez la generación de líneas celulares Cas9 inducibles estables. Brevemente, las células de cáncer de próstata humano PC3-ML y LNCaP se infectaron con un vector de lentivirus Streptococcus pyogenes Cas9 inducible por DOX (Lenti-iCas9; EditR Partículas de nucleasa lentiviral inducible hEF1aBlastCas9; MOI 0.3) durante 6 h (LNCaP) o durante la noche (PC3-ML), dependiendo de la susceptibilidad inherente de la línea celular a la toxicidad del virus.

Posteriormente, las líneas celulares infectadas se sometieron a selección de blasticidina (7,5 μg/ml) y a expansión de colonias unicelulares. Se utilizaron estudios de Western blot para seleccionar las líneas celulares PC3-ML y LNCaP Lenti-iCas9 de colonia única que exhiben la expresión cas9 más robusta basada en un curso de tiempo de inducción DOX (Figura 2A). Este sistema lentiviral inducible Cas9 fue estrechamente controlado y, tras la retirada de DOX durante 120 h, la mayor parte de la proteína Cas9 fue eliminada de las células (Figura 2A). Una curva de concentración de DOX determinó que 250 ng/mL DOX era la dosis óptima para inducir una expresión robusta de la proteína Cas9 en estas líneas celulares de próstata Lenti-iCas9 (Figura 2B). Utilizando una herramienta de diseño de crRNA en línea²³, se diseñaron crRNAs únicos (dos crRNAs de 5' y dos crRNAs de 3' flanqueando cada locus knockout de miRNA planificado para permitir cuatro posibles combinaciones de ARN guía de 5' y 3') que se dirigieron a toda la región del cúmulo miR-888 de ~35 kb; combinaciones de grupos más pequeños dentro de la familia miR-743 o la familia miR-891; así como deleciones individuales de miRNA (miR-888, -891a) (Figura 3A). Al realizar los experimentos CRISPR, las líneas celulares Lenti-iCas9 de cáncer de próstata humano se cultivaron en medio suplementado con 250 ng / ml DOX durante 48 h para inducir la expresión de Cas9.

Luego, las células se transfectaron en un formato de placa de 24 pocillos con el artracrN universal sintético complejado (relación molar 1: 1) con un conjunto único de ARNcr genómicos específicos del sitio de 5 'y 3' (Tabla 2). DoX se eliminó del medio de cultivo celular 48 h después de la transfección para eliminar la proteína Cas9 de las células de cáncer de próstata. Los pozos fueron cosechados 48 h después (96 h después de la transfección) y un tercio de cada pellet celular cosechado se preparó para el genotipado pcrizado utilizando lisados celulares crudos (Tabla 3). El análisis de electroforesis en gel de las reacciones de PCR indicó que el tamaño de fragmento de ADN predicho que representa el genotipo knockout se amplificó para cada transfección CRISPR (Figura 3B). La secuenciación del ADN de estos fragmentos aislados de PCR knockout confirmó que los ARN guía transfectados de 5' y 3' dirigieron la escisión/ligadura de Cas9 ~ 3 nt aguas arriba de los sitios PAM y validaron la pérdida genómica del locus miRNA objetivo (ejemplo representativo que se muestra en la Figura 4C). Dado que el grupo miR-888 reside en una región intergénica del cromosoma X (lejos de cualquier gen que codifique proteínas), no se anticipó que las líneas celulares knockout, que a menudo poseían INDEL en el sitio de escisión de Cas9 debido a NHEJ, causarían efectos artificiosos aguas abajo.

Aunque las reacciones de transfección CRISPR fueron exitosas (Figura 3B), las células transfectadas representaron una población de células mixtas de células transfectadas (knockout) y no transfectadas (tipo salvaje). Esta población también representó una mezcla de células portadoras de deleciones homocigotas y heterocigotas para el locus miRNA dirigido. Las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y PC3 se derivan de hombres que poseen cariotipos anormales que incluyen dos cromosomas X^31,32. Por lo tanto, una parte de cada reacción de transfección celular se diluyó en serie en un formato de placa de 96 pocillos para obtener líneas de colonias unicelulares. Estas colonias fueron examinadas por PCR para seleccionar líneas celulares homocigotas que carecían de todas las copias del locus de miRNA objetivo.

Era importante seguir este procedimiento de manera oportuna, ya que los datos anteriores han indicado un papel para el grupo miR-888 en la promoción del crecimiento de células tumorales y la agresividad de la enfermedad. Se predijo que las células cancerosas que portaban deleciones CRISPR para los miembros del grupo miR-888 crecerían más lentamente que las células de tipo silvestre. Una preocupación válida era que, con el tiempo, los pozos transfectados por ARN guía, que contenían una población mixta de células de tipo salvaje y knockout de miRNA, darían como resultado que las células de tipo salvaje superaran rápidamente a las células mutantes comprometidas en cultivo. Se observó que esto ocurría y fue especialmente pronunciado en experimentos con las líneas celulares PC3-ML altamente agresivas. Por lo tanto, los pasos que involucran diluciones en serie para generar líneas de colonias unicelulares o preparación celular para el criostatoraje se realizaron dentro de las 48-72 h posteriores a la realización de los experimentos de transfección CRISPR para preservar las células knockout en las muestras de población mixta.

La parte más laboriosa del flujo de trabajo de CRISPR para el clúster miR-888 fue la generación de deleciones de miRNA homocigotas de colonias unicelulares. Un desafío en este proceso fue que las células LNCaP y PC3-ML cultivadas generalmente no prosperaban bien cuando se enchapaban a densidades de una sola célula. Además, el crecimiento celular pareció estar fenotípicamente comprometido tras la pérdida combinatoria de los miembros del grupo miR-888 (y correlacionado con la agresividad de la línea celular). Por lo tanto, para algunas de las reacciones de transfección dirigidas a ciertas combinaciones de locus de miRNA, se requirieron diluciones celulares adicionales (utilizando un formato de 96 pocillos) para generar suficientes líneas de colonias de una sola célula para el genotipado. Al examinar los genotipos de las colonias unicelulares mediante imágenes de gel de electroforesis, fue útil comparar la intensidad de banda del tipo salvaje en comparación con los fragmentos de PCR knockout y determinar si la línea celular era heterocigota (igual intensidad de banda) o representaba una colonia multicelular (intensidad de banda desigual), que se beneficiaría de rondas adicionales de diluciones unicelulares. Si se observó que las colonias celulares poseían fragmentos de PCR de tamaño anormal e inconsistentes con los genotipos de tipo salvaje o knockout, estas líneas se eliminaron del estudio.

La secuenciación del ADN de fragmentos aislados de PCR consistentes para los genotipos de tipo salvaje y knockout se revalidó para cada colonia unicelular establecida y se confirmó utilizando métodos independientes (es decir, qRT-PCR, WGS). En términos de la eficiencia típica de generar líneas celulares nulas homocigotas en estos experimentos, esto varió con el locus de miRNA objetivo y el tipo de célula utilizada. Por ejemplo, la eficiencia en la obtención de líneas eliminatorias mir-891a de una sola colonia utilizando LNCaP fue del 30%, pero se redujo a ~ 7% en células PC3-ML. Esta diferencia podría deberse a diferencias inherentes de tipo celular (por ejemplo, las células PC3-ML poseen tasas de división /potencial metastásico más altas que las células LNCaP). Las diferencias de eficiencia de CRISPR también podrían reflejar el impacto funcional de la pérdida de miRNA (por ejemplo, miR-891a promueve el crecimiento celular y la agresividad ^9,10) y, por lo tanto, los fenotipos knockout podrían magnificarse en líneas celulares más agresivas como PC3-ML. La obtención de líneas de una sola colonia para deleciones de locus miRNA más grandes del grupo miR-888 exhibió eficiencias reducidas. No fue posible determinar si esto se debió a la eliminación de regiones más grandes del ADN o se subrayaron las funciones funcionales esenciales y superpuestas de los miembros de miR-888 en las células de cáncer de próstata.

La descripción detallada y el análisis fenotípico de las líneas celulares de racimo miR-888 eliminadas expandidas por colonias unicelulares generadas a partir de este flujo de trabajo están en curso y se publicarán en otros lugares. Como resultado representativo de las deleciones de miRNA generadas en estos estudios de edición de genes CRISPR, se muestran los hallazgos para las células de cáncer de próstata LNCaP que llevan una deleción individual mir-891a. Las colonias unicelulares fueron genotipadas por PCR y verificadas en secuencia (Figura 4A-C). No se analizaron las líneas celulares que presentaban fragmentos de PCR de tamaño anormal (por ejemplo, el clon L14 H7 que se muestra en la Figura 4D). Una vez que se obtuvieron colonias monocelulares de tipo knockout y salvaje para el locus mir-891a, se realizaron estudios funcionales. Trabajos anteriores han demostrado que la sobreexpresión de miR-891a (vector lentiviral imitador de miRNA) induce el crecimiento de células^{prostáticas 9} y, por lo tanto, se predijo que la pérdida de miR-891a mostraría efectos recíprocos. Los ensayos de proliferación de WST-1 que compararon mir-891a knockout y células de tipo salvaje confirmaron esta hipótesis, y la pérdida de miR-891a resultó en un crecimiento más lento (Figura 4D, E).

Figura 1: Flujo de trabajo de edición de genes CRISPR para generar deleciones de grupos de miRNA. (A) El ARN guía consiste en los oligonucleótidos de crRNA sintético recocido y tracrRNA (relación molar mixta de 1: 1). El oligonucleótido crRNA está diseñado para contener una secuencia guía única de 5'-terminal 20 nt (amarilla) complementaria al sitio de ADN genómico objetivo y es seguido por una secuencia de repetición invariante de 22 nt Streptococcus pyogenes (verde) que se empareja con el oligonucleótido de ARNtra. Las flechas rojas indican que los sitios de escisión de ADN de doble cadena de la enzima Cas9 generalmente se encuentran 3 nt aguas arriba del PAM. (B) Este flujo de trabajo experimental representa un solo pozo de una placa de 24 pocillos. Las células infectadas con un vector de lentivirus Cas9 inducible por DOX (Lenti-iCas9, MOI 0.3) se cultivan en medio con DOX durante 48 h para inducir la expresión de la proteína Cas9. Dos ARN guía sintéticos (relación molar mixta de 1:1 de crRNA::tracrRNA) se transfectan en células inducidas por Cas9. Los ARN guía escoltan a Cas9 a los sitios de ADN genómico (5' y 3') que flanquean la región del grupo de miRNA objetivo de eliminación. Las células se preparan 48 h después de la transfección para la dilución utilizando un formato de 96 pocillos para generar colonias unicelulares para genotipado por PCR y análisis fenotípicos aguas abajo. Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; miRNA = microARN; crRNA = ARN CRISPR; tracrRNA = ARN CRISPR transactivante; nt = nucleótido; Cas9 = endonucleasa asociada a CRISPR; PAM = motivo adyacente protoespaciador; DOX = doxiciclina; MOI = multiplicidad de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Líneas celulares de cáncer que llevan un casete lentiviral Cas9 inducible por doxiciclina que exhibe una regulación estricta de la proteína Cas9. (A) El análisis de Western blot mostró que las líneas celulares PC3-ML de cáncer de próstata humano infectadas con el vector Lenti-iCas9 (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) y cultivadas durante 48 h en un medio que contenía 250 ng / mL DOX expresaron niveles óptimos de proteína Cas9. La expresión de Cas9 se normalizó a la expresión de GAPDH. (B) Las células PC3-ML cultivadas en medio con 250 ng/mL DOX durante 48 h y 120 h (+DOX) mostraron una expresión robusta de la proteína Cas9. La eliminación de DOX del medio (-DOX) durante 120 h (120 h después) dio como resultado el aclaramiento de la proteína Cas9, medido por el análisis de Western Blot. Se obtuvieron resultados similares al generar la línea celular LNCaP Lenti-iCas9 (no mostrada). Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas9 = endonucleasa asociada a CRISPR; DOX = doxiciclina; MOI = multiplicidad de la infección; GAPDH = gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diseño experimental CRISPR de alto rendimiento para generar múltiples combinaciones de deleción de cúmulos miR-888 en un solo experimento. (A) Diagrama del cúmulo miR-888 ubicado en el cromosoma humano Xq27.3, que indica los miembros de la familia miR-743 conservados en mamíferos mir-892c, -890, -888, -892a y -892b (cajas azules) y los miembros de la familia miR-891 específicos de primates miR-891a y -891b (cajas granates). Se utilizaron oligonucleótidos sintéticos únicos de CRRNA (flechas verdes) para generar las combinaciones de knockout de racimo miR-888. Los cebadores de PCR hacia adelante y hacia atrás (pequeños rectángulos rojos) fueron diseñados para genotipar células y detectar knockouts. (B) Este resultado representativo muestra 25 reacciones CRISPR en células PC3-ML transfectadas (Lenti-iCas9) que se dirigieron a un rango de combinaciones de knockout de clúster miR-888 en un solo experimento. Cada pozo transfectado de una placa de 24 pocillos contenía dos gRNAs únicos que flanqueaban los lados 5' y 3' del locus genómico (Δ) de miRNA objetivo (como se enumera en la Tabla 2). Se prepararon lisados celulares crudos para cada reacción CRISPR y GENOtipado por PCR. Los fragmentos aislados de PCR que migraron a los tamaños de knockout previstos por electroforesis en gel fueron secuenciados con ADN y validados para la escisión Cas9 dirigida y la eliminación del locus miRNA. Los tamaños de pb de fragmentos de WT PCR predichos se indican entre paréntesis, y los tamaños deseados de fragmentos de PCR CRISPR KO se muestran en la parte inferior del gel. Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas9 = endonucleasa asociada a CRISPR; ARNg = ARN guía; DOX = doxiciclina; bp = par de bases; WT = tipo salvaje; KO = nocaut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Células de cáncer de próstata eliminadas para mir-891a utilizando la edición de genes CRISPR que exhibe proliferación suprimida. (A) Diseño de cebadores de PCR (púrpura) y los dos ARN guía de 5' y dos 3' (naranja) dirigidos a secuencias genómicas que flanquean el gen mir-891a (verde). (B) El genotipado por PCR de células LNCaP transfectadas con ARN guía indicados de 5' y 3' confirmó que se obtuvieron deleciones de Δmir-891a para las cuatro combinaciones de ARN guía. Los lisados celulares se hicieron a partir de poblaciones de células mixtas 48 h después de la transfección. (C) Los fragmentos de PCR fueron secuenciados y validados. Un ejemplo representativo muestra la secuencia de ADN de las células transfectadas tratadas con ARN guía 5A (891a) y 3B (891a), lo que resulta en el sitio de escisión Cas9 predicho (3 nt aguas arriba del sitio PAM) y la deleción CRISPR Δmir-891a. (D) Se obtuvieron colonias unicelulares y se genotipó PCR. El clon L14 G9 fue validado por secuencia como un KO y el clon L14 G9 como un WT para el gen mir-891a . (E) se demostró previamente que miR-891a induce el crecimiento de células de cáncer de próstata y, por lo tanto, se predijo que la pérdida de miR-891a tenía el fenotipo recíproco. Los ensayos WST-1 de células de cáncer de próstata eliminadas para mir-891a (L14 G9 [KO], azul) mostraron una proliferación suprimida en comparación con las células WT (L14 G9 [WT], rojo). Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas9 = endonucleasa asociada a CRISPR; WT = tipo salvaje; KO = nocaut; WST-1 = sal de tetrazolio soluble en agua-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La reacción de PCR se establece en hielo.
Componente	Reacción de 25 μL	Concentración final
5x Tampón de ADN polimerasa	5 μL	1x
Imprimación pcr de avance (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
Imprimación de PCR inversa (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
DNTP de 10 mM	0,5 μL	200 μM
ADN polimerasa (2 U/μL)	0,25 μL	0,125 U/ 25 μL
Lisado de células crudas	1 - 4 μL	variable
Agua libre de nucleasas	hasta 25 μL
Condiciones del termociclador para la reacción por PCR:
Paso	Temperatura	Hora
Desnaturalización inicial	98 °C	3 min
	98 °C	10 s
35 ciclos	62 °C	15 s
	72 °C	15 s
Prórroga final	72 °C	10 minutos
Sostener	4 °C

Tabla 1: Condiciones de reacción por PCR para el genotipado de lisado crudo. Abreviatura: dNTP = desoxinucleótidos.

Sitio de eliminación dirigido a CRISPR	Combinación de ARN guía	Tipo salvaje (bp)	Nocaut (bp)	Pares de imprimaciones pcristas
∆Clúster completo	5A(891a)+3A(892c) 5B(891a)+3A(892c) 5A(891a)+3B(892c) 5B(891a)+3B(892c)	35,664	389 496 378 485	891a FWD 892c REV
∆892c/890/888	5A'(888)+3A(892c) 5B'(888)+3A(892c) 5A'(888)+3B(892c) 5B'(888)+3B(892c)	2,739	478 487 467 476	888 FWD 892c REV
∆892c/890	3A'(888)+3A(892c) 3B'(888)+3A(892c) 3A'(888)+3B(892c) 3B'(888)+3B(892c)	2,739	710 754 699 743	888 FWD 892c REV
∆892b/892a	5A'(888)+5A(892b) 5B'(888)+5A(892b) 5A'(888)+5B(892b) 5B'(888)+5B(892b)	2,938	554 547 573 566	892b FWD 888 REV
∆892b/892a/888	5A(892b)+3A'(888) 5A(892b)+3B'(888) 5B(892b)+3A'(888)	2,938	322 278 341	892b FWD 888 REV
familia ∆743	5A(892b)+3A(892c) 5B(892b)+3A(892c) 5A(892b)+3B(892c) 5B(892b)+3B(892c)	5,015	370 389 359 378	892b FWD 892c REV
familia ∆891	5A(891a)+3A(891b) 5B(891a)+3A(891b)	27,294	330 270	891a FWD 891b REV
∆891a	5A(891a)+3A(891a ) 5A(891a)+3B(891a ) 5B(891a)+3A(891a ) 5B(891a)+3B(891a)	554	333 273 454 394	891a FWD 891a REV

Tabla 2: Guía CRISPR de ARN utilizados para generar combinaciones de knockout de clúster miR-888. Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; bp = par de bases; FWD = adelante; REV = reverso.

Cebador	Secuencia	Tm (°C)
888 FWD	AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG	52.2
888 REV	CTGGATGATGGCCAAGACAAG	55.9
891a FWD	TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA	53.9
891a REV	TTCATCTTGCTGCTACCTGTC	54.8
891b REV	TCATCTTGCTGCTATACGTCCT	55.6
892b FWD	GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA	53.5
892b REV	CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC	53.5
892c FWD	TGTGAGCACCTACAGGTTAG	53.9
892c REV	CACTCTCACTTGGCTTCATG	53.5

Tabla 3: Cebadores de PCR utilizados para el genotipado. Abreviaturas: FWD = adelante; REV = reverso; Tm = temperatura de fusión.

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Discussion

Este procedimiento de edición de genes CRISPR permite al investigador generar rápidamente un panel completo de líneas celulares que llevan combinaciones únicas de deleción de grupos de miRNA. La transfección de ARN guía sintéticos compuestos por ARNcr genómicos específicos del sitio 5' y 3' recocidos con arNN trazado sintético (relación molar 1:1) en este protocolo evita la subclonación vectorial de plásmidos que consume mucho tiempo y permite un diseño experimental más flexible y de alto rendimiento utilizando un formato de 24 pocillos. La generación de líneas celulares que llevan un casete lentiviral Cas9 inducible por DOX permite una expresión cas9 robusta y estrechamente regulada por DOX durante la transfección celular de ARN guía y la eliminación rápida de esta proteína bacteriana tras la retirada de DOX del medio de cultivo en pasos posteriores. Este procedimiento también se basa en lisados celulares crudos para el genotipado por PCR, que requiere un mínimo de material celular para el análisis y evita el uso de métodos de purificación de ADN de columna de sílice costosos y laboriosos o la necesidad de medir las concentraciones de ácido nucleico utilizando un espectrofotómetro, simplificando aún más los métodos para el investigador.

De hecho, los resultados representativos compartidos aquí mostraron una adaptación exitosa de este método para transfectar líneas celulares de cáncer de próstata humano con 32 combinaciones únicas de ARN guía en un solo experimento y generar múltiples líneas eliminatorias de colonias unicelulares que llevan deleciones para toda la región del grupo miR-888 de ~ 35 kb; combinaciones de deleción más pequeñas para los miembros del grupo miR-888 pertenecientes a las familias miR-743 y miR-891a; así como deleciones para miembros individuales de miRNA dentro del grupo miR-888. Este flujo de trabajo generó un valioso recurso de línea celular para comenzar a diseccionar molecularmente la red de grupos miR-888 en el contexto de la enfermedad de próstata humana y determinar cómo los miembros del grupo miR-888 se superponen funcionalmente o interactúan sinérgicamente / antagonistamente entre sí para regular el crecimiento del tumor de próstata, la agresividad al cáncer y la resistencia a los medicamentos (que se publicará en otro lugar). Estos estudios serán cruciales a medida que esta investigación avance hacia aplicaciones diagnósticas y terapéuticas para el tratamiento de pacientes con formas avanzadas y metastásicas de cáncer de próstata.

Hay varios pasos críticos en este protocolo de edición de genes CRISPR de alto rendimiento que los investigadores deben considerar cuidadosamente al adaptar este método para estudiar redes de grupos de miRNA adicionales en otros contextos de enfermedad. En primer lugar, el paso más importante en este proceso es el diseño cuidadoso de los ARN guía que flanquean el grupo de miRNA para la eliminación medicada con CRISPR, así como los ARN guía adicionales para eliminar miARN individuales o combinaciones de miembros del grupo de miRNA. El investigador debe considerar cuidadosamente no interrumpir los genes circundantes o los elementos reguladores, especialmente si el grupo de miRNA reside dentro de un intrón de genes o está situado antisentido de otro gen. Existen recursos de predicción CRISPR fuera de objetivo 24,25,26,27 disponibles que pueden ayudar al investigador a elegir los oligonucleótidos de ARNcr más discriminantes para sintetizar. Este flujo de trabajo describe el diseño de dos CRRNAs de 5' y dos 3' que flanquean cada locus de miRNA dirigido que permiten probar cuatro combinaciones únicas de ARN guía en el paso de transfección CRISPR y aumentan las posibilidades de generar la línea celular knockout deseada. Sin embargo, el investigador solo necesita una de estas combinaciones de ARN guía para trabajar con éxito para interrumpir un locus particular del gen miRNA.

En segundo lugar, el investigador debe decidir el método más apropiado para administrar Cas9 a las células para la edición del gen CRISPR. Este procedimiento utilizó el sistema de expresión lentiviral Cas9 inducible por DOX, pero los enfoques alternativos para la producción de proteínas Cas9 (por ejemplo, la proteína recombinante Cas9, la entrega de ARNm Cas9 o el uso de sistemas convencionales de vectores de plásmidos de expresión Cas9) se pueden adaptar fácilmente para este protocolo. Por ejemplo, las consideraciones experimentales podrían dictar el uso de la expresión transitoria de Cas9 frente a la generación de líneas celulares de expresión lentiviral estables, el promotor utilizado para impulsar Cas9 (ubicuo, específico del tipo de célula, inducible) y la incorporación de sistemas de selección positivos / negativos para garantizar la entrega del vector de expresión cas9 a las células de interés (es decir, resistencia a los antibióticos).

En tercer lugar, es importante genotipar rápidamente células transfectadas de población mixta dentro de las 48-72 h posteriores a la entrega de ARN guía en caso de que la pérdida del grupo de miRNA pueda afectar negativamente la viabilidad / crecimiento de las células. Por ejemplo, al eliminar factores promotores de tumores como miR-891a en líneas celulares de cáncer de próstata, se observó que estas células knockout mir-891a crecieron más lentamente que las células no tratadas y, posteriormente, las células de tipo salvaje superaron rápidamente a la población celular. Finalmente, es crucial integrar métodos de validación adicionales para garantizar la eliminación del locus de miRNA durante el proceso de detección genotípica, especialmente para deleciones genómicas más grandes. Estas medidas incluyen el uso de controles internos de genotipado de PCR que solo se detectan si el alelo de tipo salvaje está presente y la realización de análisis de qRT-PCR en colonias de una sola célula para garantizar que las líneas celulares knockout no expresen los miRNAs objetivo. Todas estas consideraciones asegurarán resultados exitosos para el investigador.

Hubo algunas limitaciones obvias encontradas al incorporar esta técnica CRISPR en el laboratorio. Por ejemplo, a pesar de la naturaleza de alto rendimiento de los pasos guía de transfección de ARN descritos en este protocolo para generar rápidamente múltiples combinaciones de deleción de grupos de miARN, el paso limitante de la velocidad de este procedimiento fue la detección de genotipos y la expansión de líneas celulares de colonia única para cada deleción de miARN mediada por CRISPR. La incorporación de estrategias de selección positiva en este protocolo sería una ventaja; sin embargo, todavía tomaría ~ 3-4 semanas expandir una línea de una colonia de una sola célula cultivada en un formato de 96 pocillos. De hecho, la recolección de al menos tres líneas celulares independientes de una sola colonia por eliminación de locus de miARN más células de tipo salvaje ayudará a garantizar que los fenotipos ensayados no se deban a efectos de artefacto / fuera de objetivo, pero esto nuevamente se suma a la naturaleza lenta de este procedimiento. El investigador también puede necesitar realizar múltiples rondas de edición de genes CRISPR para obtener líneas celulares nulas homocigotas. Esto es especialmente pronunciado en estudios que utilizan líneas celulares de cáncer inmortalizadas establecidas que a menudo poseen un complejo paisaje genómico de reordenamientos cromosómicos y cariotipos anormales.

Por ejemplo, este estudio representativo utilizó líneas celulares de cáncer de próstata humano derivadas de LNCaP y PC3 para generar deleciones para el grupo miR-888, mapeándose en el cromosoma X. Era importante reconocer que estas líneas celulares de cáncer de próstata derivadas de hombres tienen cariotipos anormales y poseían dos cromosomas X (y las células PC3 también tienen translocaciones parciales del cromosoma X en otros autosomas)^31,32. A pesar de estas condiciones, la edición de genes CRISPR fue lo suficientemente robusta como para generar knockouts homocigotos utilizando estas líneas celulares de próstata. Sin embargo, puede haber casos en que la línea celular de un investigador con un cariotipo anormal (por ejemplo, inserciones, deleciones, inversiones, duplicaciones) podría albergar "mutaciones invisibles" que oscurecerán la detección de segundas (o más) copias del locus genético objetivo debido a la falta de elementos que se requieren para una detección exitosa utilizando los cebadores de PCR diseñados / ARN guía. Esto subraya la importancia de verificar las líneas celulares CRISPR nulas homocigotas utilizando métodos independientes (es decir, qRT-PCR, northern blot, WGS) antes de realizar ensayos funcionales. Por último, este protocolo está diseñado para eliminar solo las combinaciones de grupos de miRNA que se mapean adyacentes entre sí. Si un investigador desea eliminar los miRNAs que están separados entre otros genes miRNA, entonces se necesitarán múltiples rondas de transfecciones CRISPR, lo que requerirá un genotipado y validación cuidadosos.

A pesar de estos desafíos, la capacidad de generar rápidamente un panel completo de combinaciones de eliminación de miRNA para cualquier grupo de miRNA dado utilizando este protocolo descrito es una gran ventaja sobre los métodos existentes en la caja de herramientas de investigación de miRNA. Los estudios de sobreexpresión que utilizan imitadores de miRNA para caracterizar la función no codificante del ARN pueden conducir a artefactos no intencionales o toxicidades celulares. Del mismo modo, el uso de inhibidores de oligonucleótidos antisentido antimir para determinar fenotipos de pérdida de función puede ser difícil ya que los antimir generalmente resultan en un derribo y no en una eliminación completa de la actividad de miRNA. Intentar utilizar combinaciones de imitadores de miRNA o antimires de miRNA para dilucidar la señalización de la red de grupos de miRNA ha demostrado ser laborioso y difícil de interpretar. Por lo tanto, la incorporación de la tecnología de edición de genes CRISPR para interrogar cómo los miembros de miRNA interactúan dentro de un grupo genómico no codificante dado permitirá a los investigadores obtener una comprensión más clara de cómo los ARN no codificantes influyen en las vías de señalización de la enfermedad y prometen tener enormes implicaciones en los campos de diagnóstico y descubrimiento de fármacos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Las líneas celulares PC3-ML fueron amablemente proporcionadas por Mark Stearn (Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel). Justin Toxey ayudó en el genotipado de PCR. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Breedan Adams, un Fondo de Investigación Traslacional Ryan y una Subvención de la Junta de Investigación de Salud de la Commonwealth (CHRB-274-11-20) a AE-K.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 10⁷ TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system

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References

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Biology

Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN

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Introduction

Protocol

Representative Results

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Materials

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