Summary
硝子体内注射は、ウイルス媒介遺伝子治療を網膜に送達することを目的として羊の目に行われました。
Abstract
網膜への治療薬の送達には、硝子体内(IVT)、網膜下、脈絡膜上、眼周囲、または局所投与を含むいくつかの方法があります。IVT薬物送達は、眼の後房を満たし、眼球の形状を維持するゼラチン状物質である眼の硝子体液への注射を含む。IVT経路は網膜下送達よりも特異的に標的化されていませんが、侵襲性ははるかに低く、さまざまな眼疾患の臨床現場で広く使用されています。
我々は以前、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介遺伝子治療製品(AAV9)の硝子体内送達の有効性を実証した。CLN5)は、天然に存在するCLN5型のニューロンセロイドリポフスチン症(NCL)を有するヒツジにおいて。罹患したヒツジは、片方の眼でIVT遺伝子治療を受け、もう片方の未治療の眼を内部対照とした。網膜の構造と機能は治療後15か月まで治療された眼で維持されましたが、未治療の眼は死後検査中に機能が徐々に低下し、重度の萎縮を示しました。ヒツジの研究に基づいて、CLN5遺伝子治療製品は、2021年9月に米国食品医薬品局によって候補治験新薬(IND)として認可されました。この論文では、治療用ウイルスベクターをヒツジの目にIVT送達するための外科的プロトコルについて詳しく説明します。
Introduction
硝子体内(IVT)、網膜下、脈絡膜上、眼周囲、または局所投与を含むいくつかの方法を網膜に送達するために使用することができる。各投与経路は、血液網膜関門または内外限界膜などの障壁を克服することを含み、送達される薬物および特定の網膜標的に応じて異なる有効性を有する1,2。
IVT薬物送達は、眼の後房を占めるゼラチン状物質である眼の硝子体液への注射を含む。硝子体液の主な機能は、眼球の形状を維持し、水晶体や網膜などの眼組織を所定の位置に保つことです。硝子体液は主に水で構成されており、少量のコラーゲン、ヒアルロン酸、およびその他の非コラーゲン性タンパク質が含まれています3。IVT注射は、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、およびいくつかの遺伝性網膜ジストロフィーを含む幅広い眼の状態を治療するために日常的に使用される単純で一般的な手順です4,5。
ニューロンセロイドリポフスノース(NCL;バッテン病)は、脳および網膜の重度の変性を引き起こす致命的なリソソーム蓄積症のグループです。現在、さまざまな遺伝子(CLN1-8、CLN10-14)の突然変異に起因するNCLの既知の変異体は13あり、主に子供に影響を与えますが、発症年齢と病気の重症度はさまざまです6。NCLは、認知および運動機能の低下、発作、視力喪失などの一般的な進行性症状を共有しています。NCLの治療法はありません。しかし、脳指向酵素補充療法は現在、セロイドリポフスチック2疾患7,8の臨床試験中であり、AAVを介した遺伝子治療は前臨床試験で大きな期待が寄せられており、CLN5遺伝子治療の臨床試験は2022年に開始される予定です9,10。
他の多くの種は、猫、犬、羊、牛など、自然に発生する形のNCLを開発します。NCLの2つのヒツジモデルが現在ニュージーランドで活発に研究されています:ボーダーデール羊のCLN5病モデルとサウスハンプシャー羊のCLN6病モデル。罹患したヒツジは、網膜萎縮および視力喪失を含むヒト疾患の臨床的および病理学的特徴の多くを示す10,11。セプチリフスチノーシス5型シマチのヒツジにおける脳指向型セロイドリポフスチックリコウソリフスチックリコウセリフスチックリコチックリセリコチックリコチックリセリコウこれは、視力を維持し、より良い生活の質を維持するために網膜を治療する必要性を浮き彫りにし、羊の眼遺伝子治療のためのプロトコルの確立につながりました。
羊の目は、眼球の寸法、硝子体容積、および網膜構造の類似性により、人間の目の優れたモデルを表しています10、12、13。この論文では、少量の(≤100 μL)の治療用ウイルスベクターをヒツジの眼にIVT送達するための外科的プロトコルについて詳しく説明します。
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Protocol
すべての実験プロトコルは、リンカーン大学の動物倫理委員会によって承認され、研究における動物の世話と使用に関する米国国立衛生研究所のガイドラインとニュージーランド動物福祉法(1999)に準拠しています。ボーダーデール羊は14 歳の出生時に診断され、リンカーン大学の研究農場で飼育されていました。生後3ヶ月のホモ接合型(CLN5-/-)雌羊3頭にIVTを1回注射し,未治療の右眼を内部コントロールとした。網膜電図および病理データを、過去の健康および罹患対照データと比較した。この研究で使用されたウイルスベクターは、ニワトリベータ作用(CBh)プロモーターとコドンに最適化されたヒツジ CLN5 (scAAV9 / CBh-oCLN5opt)を含む自己補完的なアデノ随伴ウイルス血清型9でした。ウイルスベクターは、米国ノースカロライナ州ノースカロライナ大学ベクターコアによって提供されました。
1.手術前
- 手術キットをオートクレーブします(図1)。
- 手術前に羊を24時間絶食させます。
- 手術前に生体重を記録します。
図1:硝子体内手術キット。 IVT手術に必要な器具には、(1)まぶたを開いたままにするための検鏡と、(2)球結膜をつかんで目を回転させるための一対の湾曲した鼻鉗子が含まれます。(3)球結膜をつかみ、眼窩にロールバックした場合に目を所定の位置に保持するための代替器具として、ストレートノーズ止血剤も含まれています。このキットは手術前にオートクレーブ滅菌されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.外科的処置
- 動物を拘束し、電子バリカンを使用して、首の片側から頸静脈の上にウールを剃ります。
- 頸静脈溝の基部に圧力を加えて頸静脈を閉塞し、隆起した静脈を視覚化します。
- 適切な量のジアゼパム(0.3 mg / kg)とケタミン(7.5 mg / kg)を滅菌注射器に吸い込み、滅菌した20 Gの針を取り付けます。.針を頸静脈に挿入し、プランジャーをそっと引き戻して、血液がハブに入り、針が静脈の内側にあることを確認します。確認したら、静脈内(頸静脈)投与によって誘導します。.
- 誘導直後に、動物を背側横臥状態に置き、首を伸ばし、喉頭鏡を使用して喉頭を視覚化しながら舌を前後に保持します。動物が息を吐くときに声帯の間に気管内チューブ(羊のサイズに応じてサイズ6.0〜9.0)を静かに挿入することにより、気管内挿管を行います。気管内カフをすぐに膨らませ、下顎の周りにネクタイでチューブを固定します。チューブを通る空気の流れを確認します。
- 羊を手術台に移し、横臥に置きます。
- 直ちに気管内チューブを麻酔装置のホースに接続して、100%酸素中のイソフルランを送達する。最初は3%〜4%のイソフルランから始め、次にメンテナンスのために2%〜3%に減らします。羊の自発換気を観察します。
- 手順全体を通して、心拍数(脈拍)、呼吸数、酸素飽和度、潮汐末CO2 レベル、および直腸体温を監視します。麻酔をかけた羊におけるこれらのパラメータの生理学的値については、 表1 を参照してください(可変ですが、ガイダンスとして使用してください)。
- 大きな無菌の正方形のドレープを外科用手術カートに置き、続いて滅菌器具を置きます。
- 注射する目の上に無菌の開窓された外科用ドレープを配置します。
- 滅菌20mLシリンジを使用して眼を無菌的に消毒し、1〜5%ポビドンヨード溶液で眼を洗浄する。
- 局所麻酔薬として、アルカイン0.5%W / V眼科溶液を1〜2滴目に塗布します。.
- ノパバラカーコリブリアイスペキュラム(10 mm)をまぶたに取り付けて、目を開いたままにします。
- 目の背外側にある球結膜を鉗子でつかみ、眼球を腹内側に回転させます。
| コンシャス | 麻酔 | 推奨される重要な介入ポイント | |
| 心拍数(拍数/分) | 50-80 (静止) から 280 (アクティブ) | 50-80 | <50、>100 |
| 呼吸数(呼吸/分) | 15-40(休憩)から350(過熱) | 10-30 | <8, >40 |
| 酸素飽和度(ミリメートルHg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| 潮汐終末CO2 (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| 体温(°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
表1:麻酔をかけた羊で監視するパラメータの生理学的値。
3.ウイルスの準備
- AAVベクターアリコートは、使用するまで−80°Cで保存してください。
- 手術当日、IVT送達に必要な数のバイアルを氷上で解凍します。
- 投与直前に、ウイルスベクターアリコートをボルテックスし、400× g で10秒間遠心分離し、内容物を回収した。
- 滅菌ろ過された1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で各ウイルスベクターアリコートを最終容量100 μLで所望の用量に希釈します。 滅菌フィルターピペットチップを使用して、滅菌1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブでベクター希釈液を調製します。ウイルスベクターと接触したすべての消耗品は消毒液で廃棄してください(材料の表を参照)。
注:元の出版物15 では、治療薬の用量(AAV9。CLN5)は1.9 x10 10 ウイルスゲノムであった。推奨される投与量は、投与される治療薬によって異なります。したがって、投与量はここに提示された標準プロトコルに含まれていません。. - AAVベクター調製物の全100 μLを、28 G x 1/2針で恒久的に取り付けられた滅菌済みの低デッドスペース1 mLシリンジに引き込み、すぐに注入します。準備から注射までの時間が2分未満であることを確認してください。
4.ウイルス投与
- 眼の外側の強膜の約7 mm後方に針を挿入し、レンズを避けるために後方に角度を付けます(図2 および 図3)。100 μLの単回注射を、網膜表面を乱すことなく、できるだけ網膜の近くにボーラスとして投与します。
- 検鏡とドレープを取り除く前に、約10〜15 mLの1〜5%ポビドンヨード溶液とそれに続く10 mLの生理食塩水で目をすすぎます。.
- 羊を裏返し、必要に応じてもう一方の目で繰り返します。
図2:眼球の腹内側回転 。 (A)歯のない鉗子で球結膜をつかみ、(B)腹内側に(つまり、鼻に向かって)回転させて、注射のために目の背外側表面を露出させます。略語:V =腹側、D =背側、M =内側、L =外側。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:射出位置と深さ。 針は眼球の背外側側に注入され、針軸の全長(0.5インチ/ 12.7mm)が眼に挿入されます。水晶体を避け、網膜にできるだけ近づけて注入するために、針の目の後方への角度に注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5.術後管理
- 手順が完了したら、イソフルランガス吸入麻酔を停止し、ラインを100%酸素で洗い流し、ホースを気管内チューブから外し、羊を回復室に移します。
- 羊を胸骨横臥状態に置き、足を下に押し込み、完全に回復するまで監視します。動物の口に障害物がないことを確認してください。
- 嚥下反射が観察されたら、気管内チューブのカフを部分的に収縮させ、チューブを口からそっと取り外します。
- 後肢の大腿二頭筋に筋肉内非ステロイド性抗炎症剤を投与し、首の側面または肩の後ろに皮下抗生物質を投与し、0.5%クロラムフェニコール点眼薬を眼球の表面に投与します。
- 羊が補助なしで立つことができるようになったら、水と食物(ルツェルンペレットと籾殻)を提供します。
- 0.5%クロラムフェニコール点眼薬を手術後7日間、1日2〜3回投与します。.
- 羊を一晩屋内に保管してから、手術後約24時間で屋外のパドックに戻ります。
- 直腸温を3週間毎日記録します。脈拍または呼吸数、食物消費量、神経行動、体温、体重、姿勢、目の健康、および不健康の臨床的兆候の変化を監視します。有害事象の兆候がある場合は、適切な獣医治療を求めてください。.
6. 生体内における有効性の評価
- IVT注射の目的が視力を維持することである場合は、網膜細胞機能を評価するための迷路検査または網膜電図(ERG)または網膜構造を評価するための光干渉断層撮影(OCT)などの方法でin vivo で有効性を監視します。
注:これらの有効性の尺度は、IVT遺伝子治療11、15、16に続いて十分に説明されています。
7.死後の組織分析
- 硝子体内注射手術後の適切なエンドポイントで承認された方法で羊の安楽死を実行します。
注:静脈内獣医安楽死薬や頸椎への貫通キャプティブボルトとそれに続く急速な放血などの推奨される安楽死方法は、他の場所で詳しく説明されています15,16。 - 外科用の鋭利な/鈍い湾曲したはさみを使用して羊の目の球体を収穫します。外側と内側の眼窩を切断して眼窩の開口部を増やし、次に結膜のひだ、結合組織、筋肉、視神経を体系的に切断して、眼球を眼窩から解放します。
- 無傷の除核アイグローブを10%ホルマリンで2時間浸漬固定した後、ブアン溶液に4時間後固定し、強膜を小さく(0.5 cm)カットして十分な灌流を可能にします。あるいは、アイグローブをDavidsonの溶液に48時間浸漬固定します。
- 3〜5μmでのルーチンパラフィンワックス包埋および切片化を介して眼組織の切片を処理します。
注:ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色および免疫組織化学的分析のための染色手順は、以前に説明されています15,16。 - 網膜の総厚さ、網膜層の厚さ、外顆粒層の細胞列の数、網膜細胞の種類、網膜グリア、または目的のタンパク質の免疫組織化学染色などの測定値によって、死後組織の有効性を評価します。
注:これらの分析のプロトコルについては、以前の出版物15,16を参照してください。
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Representative Results
セロイドリポフスチ NCLのヒツジの網膜機能障害および変性を減弱させるCLN5遺伝子治療ベクターのIVT送達の有効性は、この研究グループ15によって以前に実証されています。罹患したヒツジは、AAV血清型9(AAV9)ベクター(AAV9)にパッケージされたCLN5の100μLIVT注射を単回受けた。CLN5)を片方の眼に挿入し、反対側の眼を未治療の内部コントロールとして機能させる。視力は、注射時の年齢(3か月)から末期疾患(18か月)まで毎月評価されました。網膜組織学の死後分析は、治療された眼と未治療の眼、ならびに年齢を一致させた健康な対照とCLN5に罹患した対照で実施されました。
網膜電図(ERG)解析では、治療を受けた眼では網膜機能が維持されていることが示されましたが、未治療の眼では、CLN5に罹患した動物と同様に低下しました(図4)15。網膜組織像は治療された眼でほぼ正常化され、網膜中心では健康な対照動物に匹敵する総網膜厚さでした。対照的に、未治療の網膜の厚さは、CLN5に罹患した動物と同等でした(図5)15。NCLの特徴的な病理学的特徴であるリソソーム貯蔵は、治療された眼では観察されなかったが、未治療の眼には存在した15。これらの結果は、IVT注射を介して送達された遺伝子治療ベクターが、CLN5に冒されたヒツジ眼の疾患病因を止めることができたことを示しています。網膜ストレスとアストログリアのマーカーであるグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)の発現は、治療を受けた眼で未治療の眼よりも低く、治療後に疾患関連炎症が弱まったことを示しています(図6)15。
図4:AAV9の硝子体内送達後のCLN5-/- ヒツジの暗順応ERG応答。CLN5. (A)CLN5-/- ヒツジ、ならびに健康な対照(青、n = 6)およびCLN5罹患(赤色、n = 6)ヒツジの治療(濃い緑色、n = 3)および未処理(明るい緑色、n = 3)の眼における経時的な平均(±SEM)ERG振幅。(B)治療済みおよび未治療の目、健康な対照、および5か月齢(黒線)および17か月(灰色線)の影響を受けた羊からの代表的なERGトレース。*は P <0.05を示す。複製されたこの図は、エルゼビアの許可を得てMurrayら15 からのものです。略語:ERG =網膜電図;AAV =アデノ随伴ウイルス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:AAV9の硝子体内送達後のCLN5-/-ヒツジの網膜の厚さ。CLN5.CLN5-/-ヒツジの治療済みおよび未治療の眼におけるH&E組織学的染色の代表的な顕微鏡写真を、年齢を一致させた対照と比較した。画像と厚さの測定は2か所で行われました。中心網膜(A-E)および末梢網膜(F-J)。(E)治療された(濃い緑、n = 3)および未治療(明るい緑、n = 3)の眼の中心網膜における平均(±SEM)網膜の厚さ(μm)を、健康な対照(青、n = 4)およびCLN5罹患型(赤、n = 4)網膜と比較した。(J)健康な対照およびCLN5罹患網膜と比較した、CLN5-/-ヒツジの治療済みおよび未治療の眼の末梢網膜における平均(±SEM)網膜厚さ(μm)。*はP<0.05を示し、****はP<0.0001を示す。スケールバー= 50μm。この図は、エルゼビアの許可を得てMurrayら15から複製されています。略語:NFL =神経線維層;GCL =神経節細胞層;IPL =内側の網状層;INL =内顆粒層;OPL =外側の網状層;ONL =外顆粒層;IS/OS = 光受容体の内側と外側のセグメント。RPE =網膜色素上皮。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:AAV9の硝子体内送達後のCLN5-/-ヒツジの網膜におけるGFAP免疫反応性。CLN5.対照と比較したCLN5-/-ヒツジの治療済みおよび未治療の眼におけるGFAP免疫反応性の代表的な共焦点画像。(A-D)GFAP免疫反応性、(E−H)DAPI核マーカー、(I−L)2つのチャネルの合成画像。スケールバー= 20μm。この図は、エルゼビアの許可を得てMurrayら15から複製されています。略語:NFL =神経線維層;GCL =神経節細胞層;INL =内顆粒層;ONL =外顆粒層;IS/OS = 光受容体の内側と外側のセグメント。GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
硝子体内注射は、ヒト眼科で最も一般的な外科的処置の1つであり、AAVを介した遺伝子治療を羊の網膜に送達するのに効果的であることが証明されています。我々は以前、AAV9の有効性を実証していた。セロイドリポフスチノーシス5遺伝子治療は、セロイドリポフスチ セリフスチの網膜機能障害および変性を弱めるために硝子体内に実施されました。この投与経路をヒトNCL患者に翻訳することも有益であることが期待されています。
羊の目への少量のIVT注射のプロトコルは、比較的簡単で非侵襲的で、容易に再現でき、専門家でなくても簡単に習得できます。成功は、網膜内の標的細胞、提供される治療、および注射自体の場所と方向に依存します。IVT注射は網膜内層を標的とするのに最も効果的であると考えられることが多いが、多くの研究者は、網膜外が疾患病因の主要な場所である疾患におけるIVT注射の有効性を実証している15,17,18,19。IVT注射後の機能的および病理学的転帰の違いは、与えられた治療の種類にも関連している可能性があります。例えば、可溶性タンパク質(例えば、CLN5)をコードする遺伝子を送達する遺伝子治療は、細胞内または膜結合タンパク質(例えば、CLN6)をコードする遺伝子を送達する遺伝子治療よりもはるかに効果的であることが示されている15。治療の標的や種類に関係なく、効果を最大化するには、注射部位と角度を正しくすることが重要です。プロトコルに記載されているように、羊の注射部位は、眼の外側の強膜の後方に約7 mmあり、後硝子体を標的とするために後方に角度を付ける必要があります。針の角度は、水晶体を避けることと、注射された薬物を網膜にできるだけ近づけることの両方です。低デッドスペースの針に28 G(またはそれ以下)x 0.5の恒久的に取り付けられた安全シリンジの使用は、注射関連の不快感や針またはハブに残るデッドボリュームを最小限に抑えるために重要です。この長さの針は、手術用顕微鏡や網膜を穿刺するリスクなしに、後角で羊の目に完全に挿入することができます。手術用顕微鏡を利用できる研究者は、これを使用して、網膜破壊を回避することに関する確実性を高めることができます。それ以外の場合は、安全注射器を使用し、治療対象の年齢での羊の目の球体の寸法を認識するだけで、この手順を安全に実行できます15。
目をつかんで内側に回転させ、注射部位を露出させる場合、目の繊細な組織に損傷を与えないように、歯のない非外傷性器具を使用することが不可欠です。目が中央に配置されている場合、強膜と虹彩の境界にある球結膜をつかみ、片手で回転させ、もう一方の手で注入することは比較的簡単です。ただし、全身麻酔下で発生する可能性のある目が中心から外れて回転している場合は、止血剤を使用して球結膜に固定し、目を所定の位置に回転させ、止血剤を所定の位置に残して手順を続行する必要があります。
ヒツジの目は頑丈で、ヒツ ジCLN5を運ぶAAV9によるIVT治療後によく回復し、注射の1週間後に治療された眼でブドウ膜炎を発症したのは1頭の羊だけでした15。この場合、ブドウ膜炎は1週間以内に解消し、視力に長期的な影響はありませんでした。この1つのケースを除いて、IVT注射の悪影響は、最初に発表された研究15、またはここで説明するプロトコルに従って3か月、6か月、または9か月齢で注射された研究プログラムの>30匹の追加動物では報告されませんでした。.ただし、研究者が術後の評価に追加することを検討したいと思うかもしれない注射の安全性の追加の定量的尺度があります。これらには、眼圧(IOP)、眼底イメージング、またはOCTの測定が含まれます。 注射前後の眼底の画像は、注射のために網膜の破壊があったかどうかを強調することができ、長期的には、一般的な網膜の健康の概要を提供することができます。
蛍光マーカーが注入される場合、眼底の蛍光画像化は、注入されたマーカー16、20の広がりを視覚化するのを助けることができる。OCTを使用して、in vivoで網膜の断面を視覚化し、注射後の潜在的な構造的損傷を特定し、治療に応答して経時的に網膜の厚さを測定することができます。注射後の視覚機能は、ERGまたは迷路テストによっても評価できます15,16。IVTウイルス媒介遺伝子治療の場合、免疫応答の影響およびAAVベクターに対する中和抗体の存在を考慮する必要があります。ヒツジについてここで概説したプロトコルの一部ではありませんが、形質導入効率を高めるために、投与経路に関係なく、遺伝子治療の前に被験者が抗AAV中和抗体の存在についてテストされることが示唆されています16,21。読者は、WhiteheadらによるAAVに対する免疫応答の問題に関するより包括的な議論に言及されている22。
IVT処置中の一般的な合併症は結膜下出血(SCH)23であり、これは針挿入中に球結膜の毛細血管が穿刺された場合に発生する可能性があります。幸いなことに、SCHは一般的に無害であり、数日以内に解決します。ただし、針を挿入するときは結膜毛細血管を避けるのが最善です。IVT注射後、注射した眼を抗生物質の点眼薬(クロラムフェニコールなど)で治療し、感染や炎症の兆候(ブドウ膜炎)がないか目を監視することが重要です。.IVT処置中の別の一般的なイベントは、IOPの増加です。これらの増加は、最も一般的には注射後の数分間の圧力の一時的なスパイクであり、長期的な損傷を引き起こしません24,25。ただし、IOP を検討およびモニターする必要がある場合もあります。緑内障などの既存の眼の状態が存在する場合、または大容量(≥100μL)が注入されている場合は、IOPを注意深く監視し、眼球の圧力を下げるために予防的前房穿刺を検討する必要があります4,16。さらに、IVT注射を繰り返す場合のIOPの繰り返しスパイクが懸念される可能性があり、上記のように減衰させる必要があります4。ここでは、単一のAAV媒介遺伝子治療の目的でIVTを実証しています。したがって、繰り返し注射の長期的な結果は大きな考慮事項ではありません。
IVT注射の制限には、解剖学的障壁を貫通する必要性と、より侵襲的な方法と比較して標的特異性が低いことが含まれます。まず、注入された物質は硝子体で希釈され、次に硝子体腔および網膜組織を通って標的細胞に拡散する距離を有する。これは、IVT注射後に内側網膜が外側網膜よりも容易に形質導入されることを意味し、希釈に対抗するためにより高い用量が必要になる可能性がある26。ここで説明するプロトコルは、硝子体を介した希釈と拡散の影響を軽減するために、網膜にできるだけ近づけて注射することの重要性を強調しています。したがって、0.5インチ/ 12.7mmの針軸の全長が目に挿入されます。全針を挿入することの追加の利点は、注入中の体液逆流の可能性が減少することです4,27。
この現在のプロトコルでは省略されていますが、体液逆流の可能性をさらに減らすために、注射後数分間針の取り外しを遅らせることをお勧めします。さらに、注入された流体の噴流が網膜を破壊したり、IOPの急速なスパイクを引き起こしたりしないように、注射はゆっくりと行う必要があり、注入速度の増加は硝子体28,29を通る拡散速度に影響を与えません。内境界膜(ILM)は、硝子体と網膜との間の一次障壁であり、網膜30への分子の移動を制限するように機能する。しかし、ILMの透過性は、消化または外科的剥離によって増加させることができ、罹患した眼において増加する可能性が高く、治療分子の浸透を容易にする。
標的特異性に関しては、IVT投与は、上記および他の場所で議論したように、網膜下および脈絡膜上などの他の眼内経路と比較して最も少ない10。しかし、新世代のAAVは、特定の細胞型へのターゲティングを強化したり、ILM31などの障壁をより効率的に克服したりする修飾を含むように日常的に開発されています。このような改変カプシドの使用は、多くのモデル種においてIVT投与後の形質導入効率を増加させた5、32、33。
Murrayらによって詳述された遺伝子治療の目的は、CLN5遺伝子の機能的コピーを送達することでした15。したがって、有効性の1つの尺度は、CLN5タンパク質を発現する形質導入細胞の存在である。私たちは、免疫組織化学を使用して、羊の脳組織で日常的に行っているように、網膜のCLN5形質導入細胞を検出しようとしました。しかし、私たちが通常浮遊脳組織で使用する抗体は、パラフィン包埋網膜組織では機能しません。網膜内の目的の遺伝子またはタンパク質を検出する別の方法のトラブルシューティングと調査が進行中であり、有効性の評価に追加されています。これを達成するための1つの潜在的な方法は、レポーター遺伝子(緑色蛍光タンパク質など)を含むウイルスベクターを注入することです。GFP)免疫組織化学によるGFP発現の評価。有効性を評価する別の方法は、定量的PCRを使用して導入遺伝子発現のレベルを評価することです。
IVT遺伝子治療は有望な潜在的な治療法であるため、大型動物におけるIVT注射のプロトコルの開発は、網膜の変性疾患、特に遺伝的要素を伴う疾患の治療に向けた重要なステップです。網膜がすでに脆弱な変性疾患の場合、IVT治療は網膜剥離または裂傷のリスクが低くなります。ヒツジと人間の目のサイズと構造の類似性を考えると、ヒツジのIVT注射の用量と量を最適化することは、クリニックへの翻訳に向けた適切なステップです。この論文では、羊の目へのIVT注射のプロトコルを詳しく説明していますが、これは安全で、眼の炎症反応の発生率が非常に低いことを示しています。この方法はまた、ヒツジのNCLの網膜成分に対処するためのAAV9媒介眼遺伝子治療の有効性を実証しています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、Steve Heap博士(BVSc、CertVOphthal)がこのプロトコルを確立し、Murrayらによって記述された注射を実行するのを支援したことに感謝したいと思います15。著者らはまた、CureKids New Zealand、Canterbury Medical Research Foundation、Neurogene Inc、およびBatten Disease Support and Research Associationからの資金提供にも感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
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