Fremstilling af cytoplasmatiske og nukleare lange RNA'er fra primære og dyrkede celler

Summary

Denne protokol tilbyder en effektiv og fleksibel metode til at isolere RNA fra nukleare og cytoplasmatiske fraktioner ved hjælp af dyrkede celler og derefter validere ved hjælp af qPCR. Dette tjener effektivt som erstatning for andre RNA-præparationssæt.

Abstract

Adskillelsen af intracellulære komponenter har været et centralt værktøj i cellulær biologi i mange år nu og har været i stand til at give nyttig indsigt i, hvordan deres placering kan påvirke deres funktion. Især er adskillelsen af nukleært og cytoplasmatisk RNA blevet vigtig i forbindelse med kræftceller og søgen efter at finde nye mål for lægemidler. Indkøbssæt til nuklear-cytoplasmatisk RNA-ekstraktion kan være dyrt, når mange af de krævede materialer kan findes inden for en typisk laboratorieindstilling. Ved hjælp af den nuværende metode, som kan erstatte dyrere kits eller andre tidskrævende processer, er der kun behov for en hjemmelavet lysisbuffer, en benchtopcentrifuge og RNA-isolationsrensningskolonner for at isolere nukleært og cytoplasmatisk RNA. Lysisbuffer bruges til forsigtigt at lyse cellens ydre membran uden at påvirke integriteten af den nukleare kappe, hvilket muliggør frigivelse af dets intracellulære komponenter. Derefter kan kernerne isoleres ved et simpelt centrifugeringstrin, da de har en højere densitet end lysisopløsningen. Centrifugering anvendes til at adskille disse områder baseret på deres densitetsforskelle for at isolere subcellulære elementer i kernen fra dem i cytoplasmaet. Når centrifugeringen har isoleret de forskellige komponenter, anvendes et RNA-oprydningssæt til at rense RNA-indholdet, og qPCR udføres for at validere separationskvaliteten, kvantificeret ved mængden af nukleært og cytoplasmatisk RNA i de forskellige fraktioner. Der blev opnået statistisk signifikante separationsniveauer, hvilket illustrerer protokollens effektivitet. Derudover kan dette system tilpasses til isolering af forskellige typer RNA (totalt, lille RNA osv.), Hvilket muliggør målrettet undersøgelse af cytoplasma-kerneinteraktioner og hjælper med at forstå forskellene i funktionen af RNA, der befinder sig i kernen og cytoplasmaet.

Introduction

Cellulær fraktionering i subcellulære komponenter muliggør isolering og undersøgelse af definerede biokemiske domæner og hjælper med at bestemme lokaliseringen af specifikke cellulære processer, og hvordan dette kan påvirke deres funktion¹. Isolering af RNA fra forskellige intracellulære steder kan muliggøre forbedret nøjagtighed af genetisk og biokemisk analyse af transkriptionsniveauhændelser og andre interaktioner mellem kernen og cytoplasmaet, hvilket tjener som det primære formål med den nuværende protokol². Denne protokol blev udviklet for at sikre isolering af cytoplasmatiske og nukleare RNA’er for at bestemme deres respektive roller i nuklear eksport og for at forstå, hvordan den subcellulære lokalisering af RNA’er i kernen og cytoplasma kan påvirke deres funktion i cellulære processer. Ved hjælp af materialer fra en typisk laboratorieindstilling var det muligt at opnå nuklear og cytoplasmatisk fraktionering mere effektivt og billigere end tidligere etablerede protokoller uden at bringe kvaliteten af resultaterne^{i fare 3}.

Derudover kan udvekslingen af molekyler mellem cytoplasma og kernen studeres direkte ved at adskille disse regioner. Mere specifikt er forståelse af transkriptomet afgørende for at forstå udvikling og sygdom. RNA’er kan dog være på forskellige modningsniveauer til enhver tid og kan komplicere nedstrømsanalyse. Denne protokol giver mulighed for at isolere RNA fra nukleare og cytoplasmatiske subcellulære fraktioner, hvilket kan hjælpe med undersøgelser af RNA og give mulighed for en bedre forståelse af et bestemt RNA af interesse, såsom lokalisering af ikke-kodende RNA’er eller analyse af splejsningskryds i kernen.

Denne protokol er optimeret til isolering af cytoplasmatiske og nukleare lange RNA’er, herunder mRNA’er, rRNA’er og lange ikke-kodende RNA’er (lncRNA’er) på grund af størrelseselektiviteten af den anvendte RNA-oprensningskolonne, som kan modificeres for at isolere andre RNA’er af interesse. Tidligere var funktionen af lange RNA’er, såsom mRNA’er og lncRNA’er, stærkt afhængig af deres respektive lokalisering i cellen ^4,5. Derfor er undersøgelsen af eksporten fra kernen til subcellulære domæner blevet mere målrettet mod at forstå den rolle, som eksport af RNA eller andre cellulære komponenter kan have på cellen. lncRNA’er tjener som et glimrende eksempel på dette, da deres oversættelse og efterfølgende virkninger i vid udstrækning afhænger af nærhed og interaktioner med andre former for RNA⁶. Desuden er udvekslingen af cellulære elementer mellem nukleare og cytoplasmatiske regioner knyttet til resistensmekanismer over for forskellige kræftbehandlinger⁷. Isoleringen af intracellulære rum har muliggjort udviklingen af nukleare eksporthæmmere, hvilket har mindsket virkningerne af resistensmekanismer over for forskellige terapier⁸.

Efter adskillelse af nukleært og cytoplasmatisk RNA udføres trin for at rense RNA’et af interesse. Da RNA-oprensningssæt almindeligvis findes i laboratorier og fungerer til at rense og isolere lange RNA’er, tjener de formålet med denne protokol godt. For RNA-oprensning er generering af 260:280-forhold større end 1,8 afgørende for at sikre kvaliteten af prøver til RNA-sekventering eller andre lignende procedurer, der kræver høje niveauer af renhed og isolering. Uregelmæssige værdier på 260:280 indikerer phenolkontaminering, hvilket viser dårlig isolering og giver unøjagtige resultater⁹.

Når RNA-oprensning er afsluttet, og 260: 280-værdier er bekræftet at være over et acceptabelt interval, blev qPCR brugt til at validere isolationsresultaterne af nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Dermed blev primere, der var specifikke for interesseområdet, brugt til at demonstrere de nukleare og cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer. I denne protokol blev MALAT1 og TUG1 anvendt som henholdsvis nukleare og cytoplasmatiske markører¹⁰. Sammen giver de mulighed for demonstration af høje niveauer af nuklear fraktionering med MALAT1, mens cytoplasmatisk fraktionering forventes at være lav. Omvendt, når TUG1 anvendes, forventes cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer at være højere end nukleare fraktioneringsniveauer.

Ved hjælp af denne protokol var det muligt at isolere RNA’er baseret på deres virkningsposition i cellen. På grund af udbredt adgang til mange materialer og anvendelse af kun lysisbuffer og densitetsbaserede centrifugeringsteknikker under dette eksperiment er anvendelighed til andre RNA-typer og andre cellulære komponenter udbredt. Dette kan give vigtige oplysninger ved at kaste lys over placeringsspecifikke udtrykshændelser, der ellers ikke ville kunne skelnes uden adskillelse.

Protocol

K562-celler anvendes til denne undersøgelse. Denne protokol er optimeret til at fungere for 1 x 10 6-5 x 106 millioner celler. Proceduren kan dog skaleres op til større cellemængder ved at øge volumenerne korrekt. 1. Fremstilling af 0,25x lysisbufferen Der fremstilles 0,25x lysisbuffer ved at blande følgende komponenter i tabel 1A.BEMÆRK: Prøver kræver ca. 300 μL 0,25x lysisbuffer. Anbefalet volumen = antal prøver …

Representative Results

For at sikre, at nuklear og cytoplasmatisk isolering var opnået, blev der udført en qPCR for at validere resultaterne. Dermed blev primere, der var specifikke for interesseområdet, brugt til at demonstrere de nukleare og cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer. I denne undersøgelse blev MALAT1 og TUG1 anvendt som henholdsvis nukleare og cytoplasmatiske primere. Sammen giver de mulighed for demonstration af høje niveauer af nuklear fraktionering med MALAT1 som en positiv kontrol for nukleare elementer, mens cytoplasma…

Discussion

I hele protokollen blev der taget nogle skridt til at optimere elementerne for at være mest effektive for cellelinjen af interesse. Mens trinene i protokollen er relativt ligetil, kan analyse og mindre justeringer under kritiske aspekter af protokollen være nødvendige. Det mest kritiske trin i protokollen er at ændre koncentrationen af lysisbufferen til en korrekt koncentration baseret på cellelinjen af interesse og det cellulære mål. Da udnyttelsen af lysisbuffer i høj grad afhænger af forstyrrelsen af cellemem…

Materials

Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.