Summary
O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a identificação de metabólitos do 2,4-dibromofenol em plantas.
Abstract
As culturas podem ser extensivamente expostas a poluentes orgânicos, uma vez que o solo é um importante sumidouro de poluentes descartados no meio ambiente. Isso cria exposição humana potencial através do consumo de alimentos acumulados por poluentes. A elucidação da absorção e metabolismo de xenobióticos em culturas é essencial para a avaliação do risco de exposição dietética em humanos. No entanto, para tais experimentos, o uso de plantas intactas requer experimentos de longo prazo e protocolos complexos de preparação de amostras que podem ser afetados por vários fatores. Culturas de calos vegetais combinadas com espectrometria de massas de alta resolução (HRMS) podem fornecer uma solução para a identificação precisa e econômica de metabólitos de xenobióticos em plantas, pois pode evitar a interferência do microambiente microbiano ou fúngico, encurtar a duração do tratamento e simplificar o efeito de matriz de plantas intactas. O 2,4-dibromofenol, um retardante de chama típico e desregulador endócrino, foi escolhido como substância modelo devido à sua ampla ocorrência no solo e ao seu potencial de absorção pelas plantas. Neste trabalho, calos vegetais foram gerados a partir de sementes de assepsia e expostos a meio de cultura estéril contendo 2,4-dibromofenol. Os resultados mostraram que oito metabólitos do 2,4-dibromofenol foram identificados nos tecidos do calo vegetal após 120 h de incubação. Isso indica que o 2,4-dibromofenol foi rapidamente metabolizado nos tecidos do calo vegetal. Assim, a plataforma de cultura de calos vegetais é um método eficaz para avaliar a absorção e o metabolismo de xenobióticos em plantas.
Introduction
Um número crescente de poluentes orgânicos tem sido descartado no meio ambiente devido às atividades antrópicas 1,2, sendo o solo considerado um importante sumidouro desses contaminantes 3,4. Os contaminantes presentes no solo podem ser absorvidos pelas plantas e potencialmente transferidos para organismos de nível trófico superior ao longo das cadeias alimentares, entrando diretamente no corpo humano por meio do consumo das culturas, levando consequentemente à exposição não intencional 5,6. As plantas utilizam diferentes vias para metabolizar xenobióticos para desintoxicação7; A elucidação do metabolismo dos xenobióticos é importante, pois controla o real destino dos contaminantes nas plantas. Como os metabólitos podem ser excretados pelas folhas (para a atmosfera) ou pelas raízes, a determinação dos metabólitos nas fases iniciais de exposição oferece a possibilidade de testar um número extenso de metabólitos8. No entanto, estudos utilizando plantas intactas requerem experimentos de longa duração e protocolos complexos de preparo de amostras que podem ser afetados por vários fatores.
As culturas de calos vegetais, portanto, são uma boa alternativa para estudar o metabolismo de xenobióticos em planta, pois podem encurtar muito o tempo de tratamento. Essas culturas excluem a interferência microbiana e a degradação fotoquímica, simplificam o efeito de matriz de plantas intactas, padronizam as condições de cultivo e requerem menor esforço experimental. Culturas de calos vegetais têm sido aplicadas com sucesso como uma abordagem alternativa em estudos metabólicos de triclosan9, nonilfenol10 e tebuconazol8. Esses estudos mostraram que os padrões metabólicos nas culturas de calos foram semelhantes aos das plantas intactas. Este trabalho propõe um método para a identificação eficiente e precisa de metabólitos de xenobióticos em plantas sem protocolos complexos e demorados. Neste trabalho, utilizamos culturas de calos vegetais em combinação com espectrometria de massas de alta resolução para a análise de metabólitos com sinais de baixa intensidade11,12.
Para tanto, suspensões de calos de cenoura (Daucus carota var. sativus) foram expostas a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol por 120 h em agitador a 130 rpm e 26 °C. O 2,4-dibromofenol foi escolhido devido à sua atividade endócrina disruptiva13 e ampla ocorrência no solo14. Os metabólitos foram extraídos e analisados por espectrometria de massas de alta resolução. O protocolo aqui proposto pode investigar o metabolismo in planta de outros tipos de compostos orgânicos que podem ser ionizados.
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Protocol
1. Diferenciação do calo de cenoura
NOTA: Autoclave todos os equipamentos utilizados aqui e realize todas as operações em uma bancada ultralimpa esterilizada por UV.
- Vernalizar as sementes imergindo as sementes uniformes de cenoura (Daucus carota var. sativus) em água deionizada a 4 °C por 16 h.
- Esterilizar superficialmente as sementes vernalizadas com etanol 75% por 20 min e, em seguida, enxaguar três vezes com água deionizada estéril em condições assépticas.
- Esterilizar as sementes com 20% H 2 O2por 20 min e lavá-las com água deionizada esterilizada seis vezes em condições assépticas.
- Germinar assepticamente as sementes semeando-as em meio MS livre de hormônios (pH 5,8, autoclavado a 121 °C por 20 min) contendo ágar-gel a 1% e incubando a 26 °C com fotoperíodo de 16 h (350 μmol/m2s) por 15 dias.
- Obter os explantes cortando o hipocótilo e o cotilédone das mudas em pequenos pedaços (0,5 cm).
- Transformar os explantes em placas de Petri (dois a quatro explantes por prato) contendo 15-20 mL de meio MS asséptico suplementado com auximona (ácido 2,4-diclorofenoxiacético; 1 mg/L) e fitocinina (6-benzilaminopurina; 0,5 mg/L) em condições assépticas.
- Incubar os explantes no escuro a 26 °C durante 3-4 semanas para induzir o calo.
- Separe os tecidos do calo (cerca de 1 cm de diâmetro) formados a partir dos explantes iniciais utilizando bisturi estéril e pinças.
NOTA: Os tecidos do calo recém-formado são de cor branca a amarelo cremoso e se fixam vagamente aos explantes iniciais.
2. Tratamento com 2,4-dibromofenol
- Dissolver 1 μg de 2,4-dibromofenol em 10 mL de meio MS líquido asséptico (a concentração final de 2,4-dibromofenol é de 100 ppb, pH 5,6-7,0).
- Adicionar 3 g do calo fresco de cenoura (passo 1.8) em frascos de vidro contendo a solução preparada de 2,4-dibromofenol (do passo 2.1) em condições assépticas. Considere isso como o tratamento com 2,4-dibromofenol.
OBS: Os frascos de vidro foram autoclavados e selados com filme de parafina. - Incluir um meio de controlo contendo apenas a solução de 2,4-dibromofenol (preparada no passo 2.1) para avaliar a degradação abiótica do 2,4-dibromofenol.
- Incluir um controlo em branco contendo apenas o calo de cenoura (sem solução de 2,4-dibromofenol) para verificar se existe qualquer contaminação potencial.
- Preparar o controle em branco contendo cenoura adicionando 3 g de calo de cenoura fresco coletado apenas em 10 mL de meio MS estéril.
- Incubar o tratamento com 2,4-dibromofenol e os controles médio e branco a 130 rpm e 26 °C no escuro em estufa por 120 h.
- Retirar os frascos de vidro da incubadora para coletar as amostras do tratamento com 2,4-dibromofenol e controles após 120 h de incubação.
OBS: Todas as amostras foram preparadas em triplicata.
3. Preparo da amostra
- Separe cuidadosamente o calo do meio MS por filtração com filtros de fibra de vidro (0,45 μm) para o tratamento com 2,4-dibromofenol e os controles. Recolher o calo após lavar com água ultrapura três vezes.
- Liofilizar o calo coletado com nitrogênio líquido e, posteriormente, homogeneizar o calo coletado (0,2 g) com um moedor de tecido de alto rendimento a 70 Hz por 3 min.
- Cravar o calo homogeneizado adicionando 50 μL de 25 mg/L substituto 4-n-NP-d4 com uma microseringa de vidro e, subsequentemente, vórtice por 1 min.
- Sonicar as amostras com 5 mL de metanol/água (1:1, v/v) em um ultrasonicator (150 W, 40 kHz) preenchido com água gelada por 30 min, para extrair 2,4-dibromofenol e os metabólitos.
- Centrifugar as suspensões a 8.000 x g a 4 °C durante 10 min e recolher os sobrenadantes por pipetagem.
- Repita os processos de extração para a amostra de calo três vezes e combine os extratos.
- Passar os extratos através de cartuchos de extração em fase sólida hidrofílica lipofílica balanceada (HLB SPE) com vazão de 1 mL/min.
OBS: Os cartuchos de SPE do HLB foram pré-tratados sequencialmente com 6 mL de metanol e 6 mL de água para remover quaisquer interferências. - Eluir os analitos passando 6 mL de metanol pelos cartuchos HLB SPE. Em seguida, concentrar os eluentes obtidos para 1 mL sob uma corrente suave de gás nitrogênio para análise instrumental.
- Injetar 10 μL dos eluentes resultantes no UPLC-Q-TOF-MS para análise do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos15.
- Filtrar todas as amostras com uma membrana de nylon de 0,22 μm antes da análise instrumental.
4. Análise instrumental
NOTA: As análises do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos foram realizadas em um cromatógrafo líquido de ultra-eficiência (UPLC) em combinação com um espectrômetro de massas micrOTOF-QII equipado com uma ionização por eletrospray (ESI), operando nos modos de íons positivos e negativos.
- Abra a porta do aquecedor de coluna e instale a coluna UPLC conectando a entrada da coluna à válvula de injeção e a saída da coluna à entrada do espectrômetro de massa.
NOTA: Uma coluna C18 (50 mm x 2,1 mm; tamanho de partícula de 1,7 μm) foi usada para a separação dos analitos a 40 °C. - Conecte a fase A móvel (água ultrapura) e a fase B móvel (metanol grau cromatografia) ao instrumento inserindo a extremidade dos tubos de solvente A e B nas garrafas de solvente correspondentes, respectivamente.
- Filtrar todas as fases móveis (500 mL para cada) através de um filtro de 0,22 μm e sonicar por mais de 30 min.
- Na janela do software, clique em Instrumento | Método de entrada para editar as condições do cromatograma líquido.
- Definir as condições de gradiente da fase móvel B da seguinte forma: fluxo de 1,0 mL/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% a 50%; 3,5-6,5 min, 50% a 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% a 5%.
- Ajuste a taxa de injeção das amostras no UPLC-Q-TOF-MS como 0,2 mL/min.
NOTA: A injeção da amostra é programada usando um amostrador totalmente automático.
- Na janela do software, selecione Método MS e, em seguida, configure os parâmetros de Q-TOF-MS: uma taxa de fluxo de gás de secagem (N2) de 8 L/min, uma temperatura de 300-350 °C; uma tensão capilar de 4.500 V; uma energia de colisão de 5-45 V; e uma faixa de varredura completa de 40-800 Da.
- Coloque os frascos para injetáveis de amostra nos locais correspondentes dos tabuleiros de recolha de amostras por número de série e volte a introduzir os frascos de amostras na câmara de amostras.
NOTA: Mantenha os tabuleiros de amostra planos e certifique-se de que a porta da câmara de amostras está fechada. - Na janela do software, selecione Arquivo | Novo para criar um banco de dados. Nomeie o banco de dados.
- Carregue o programa de exemplo criado acima selecionando Arquivo MS | Arquivo de entrada | Volume de Injetagem.
- Salve o banco de dados na pasta de exemplo do projeto clicando em Arquivo | Salve.
- Selecione Executar | Inicie na janela principal do software e, em seguida, selecione Adquirir dados de exemplo e clique em OK na janela da execução da lista de exemplo inicial para coletar dados.
NOTA: O cromatograma em tempo real pode ser visualizado clicando em Cromatograma | Atualização em tempo real durante o processo de aquisição de dados. - Processe os dados no software selecionando a linha de dados de destino e clicando na janela Cromatograma para visualizar o cromatograma de varredura MS.
- Na janela Cromatograma , clique em Exibir | TIC | ScanWaveDS - Brasil | Adicionar rastreamento | OK para obter a filha digitalizar espectros de massa.
- Identificar os metabolitos comparando os cromatogramas do tratamento com 2,4-dibromofenol e os controlos.
- Elucidar os candidatos a metabólitos pelos padrões de tempo de retenção, massa e fragmentação16,17.
NOTA: O erro de precisão de massa entre os valores m/z experimentais dos iões precursores dos candidatos a metabolito para o seu correspondente m/z teórico deve ser inferior a 10 ppm.
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Representative Results
As etapas do protocolo estão representadas na Figura 1. Seguindo o protocolo, comparamos o cromatograma do extrato de calo de cenoura do tratamento com 2,4-dibromofenol com os controles, e encontramos oito picos distintos que estão presentes no tratamento com 2,4-dibromofenol, mas ausentes nos controles (Figura 2). Isso indica que um total de oito metabólitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 e M187) foram detectados com sucesso no calo de cenoura tratado com 2,4-dibromofenol. Adicionalmente, o pico do 2,4-dibromofenol de origem (tempo de retenção = 0,85 min) não foi encontrado no cromatograma do tratamento com 2,4-dibromofenol (Figura 2), indicando que o 2,4-dibromofenol foi rapidamente metabolizado no calo de cenoura nas condições experimentais.
As informações cromatográficas e de massa utilizadas para identificar os metabólitos do 2,4-dibromofenol no calo de cenoura estão resumidas na Tabela 1. O 2,4-dibromofenol incubado em calo de cenoura levou à formação de metabólitos por conjugação direta com glicose (M562, M545, M661 e M413) e aminoácidos (M339, M380 e M424). Por exemplo, M413 produziu fragmentos em m/z 250,8954 e 163,1485, que correspondem a ftalato de dibutila (DBP) e glicose (C6H11O5). M413 foi posteriormente metabolizado para formar metabólitos de conjugação de dissacarídeos M661, M545 e M562, adicionando pentose ou hexose. Especula-se que os M339, M380 e M424 sejam 2,4-dibromofenol alanina, 2,4-dibromofenol acetilalanina, e ácido 2,4-dibromofenol acetilaspártico, pois apresentam a característica perda neutra de aminoácidos (C 3 H 6 NO2), acetilalanina (C 5 H 8 NO3) e ácido acetilaspártico (C6H8NO5), produzindo os fragmentos correspondentes em m/z 89,0932, 129.1140 e 173.1235, respectivamente15. Os resultados apresentados sugerem que as culturas de calos vegetais podem ser utilizadas como uma ferramenta eficiente e confiável para elucidar o metabolismo de xenobióticos em culturas.
Figura 1: Método esquemático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cromatogramas para o 2,4-dibromofenol (imagem inserida) e os metabolitos do 2,4-dibromofenol. Esse número foi adaptado com permissão de Sun et al.15. Direitos autorais (2018) American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Metabólito | RT (min) | Modo ESI | Observado m/z |
Calculado m/z |
Fórmula predicada | Fragmentos (m/z) | Nível de confiança | |||
| M562 | 0.7 | -H | 562.201 | 562.201 | C18H26Br2O10 | 250,8954 (-DBP) | Nível 2b | |||
| 170.9914(-Br) | EM, MS2 | |||||||||
| M545 | 1.6 | -H | 545.151 | 545.1506 | C17H22Br2O10 | 250,8954 (-DBP) | Nível 2b | |||
| 170.9914(-Br) | ||||||||||
| 528,1433 (-OH) | EM, MS2 | |||||||||
| M661 | 2.9 | -H | 661.222 | 661.2228 | C21H26Br2O14 | 250,8954 (-DBP) | Nível 2b | |||
| 410.3274(-C15H23O13) | EM, MS2 | |||||||||
| M413 | 4.1 | -H | 413.036 | 413.036 | C12H14Br2O6 | 250,8954 (-DBP) | Nível 1 | |||
| 163.1485(-C6H11O5) | ||||||||||
| 207.8938(250-CO2) | Padrão sintético, RT, MS, MS2 | |||||||||
| M339 | 5.2 | +H | 339.994 | 339.9886 | C9 H9Br2NO3 | 250,8954 (-DBP) | Nível 2b | |||
| 87.0773(-C3H6NÃO2) | EM, MS2 | |||||||||
| M380 | 5.5 | -H | 380.01 | 380.0094 | C 11 H11Br2NO4 | 250,8954 (-DBP) | Nível 2b | |||
| 129.1140(-C5H8NO3) | EM, MS2 | |||||||||
| M424 | 5.8 | -H | 424.012 | 424.0189 | C12H11Br2NO6 | 250,8954 (-DBP) | Nível 2b | |||
| 173.1235(-C6H8NO5) | EM, MS2 | |||||||||
| M187 | 6.1 | -H | 187.995 | 187.9988 | C6H5BrO2 | 109.1027(-Br) | Nível 1 | |||
| 170,9914 (-OH) | Padrão autêntico, RT, MS, MS2 | |||||||||
Tabela 1: Resumo do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos descobertos em extratos de calos de cenoura. Essa tabela foi adaptada com permissão de Sun et al.15. Direitos autorais (2018) American Chemical Society.
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Discussion
Este protocolo foi desenvolvido para identificar eficientemente a biotransformação de xenobióticos em plantas. A etapa crítica deste protocolo é o cultivo do calo vegetal. A parte mais difícil é a diferenciação e manutenção do calo vegetal, pois o calo vegetal é facilmente infectado e desenvolvido para os tecidos vegetais. Portanto, é importante certificar-se de que todos os equipamentos utilizados sejam autoclavados e que todas as operações sejam realizadas em condições assépticas. A diferenciação e manutenção do calo vegetal devem ser feitas no escuro para evitar crescimento autotrófico e superdesenvolvimento. Além disso, a dose e os tipos de fitohormônios suplementados no meio MS são críticos para o diferencial do calo vegetal, que deve levar em consideração a espécie vegetal. Uma superdosagem de fitohormônios faz com que o calo desenvolva um sistema vascular, mas fitohormônios insuficientes limitam a diferenciação do calo vegetal18. Os estoques de meio MS e fitohormônios devem ser preparados frescos. Recomenda-se a autoclave do meio MS antes da introdução dos fitohormônios e do hipocótilo asséptico.
Pigmentos como a clorofila em plantas intactas são um problema geral nas medidas de LC-HRMS 19,20. O calo vegetal é derivado do hipocótilo asséptico e é transparente sem clorofila. Isso significa que a cultura do calo vegetal pode otimizar o efeito de matriz da planta intacta e oferecer uma técnica de preparação de amostra fácil, mas eficiente, sem etapas de remoção de pigmento. A análise dos metabólitos de xenobióticos em calos vegetais foi realizada com LC-HRMS de forma não direcionada15. A cultura do calo vegetal combinada com a análise não-direcionada permite a identificação efetiva de um perfil em larga escala de compostos metabólicos. Essas vantagens tornam o método ideal para a compreensão mecanicista do metabolismo de xenobióticos em plantas. No entanto, ainda existem várias limitações para o protocolo. Por exemplo, o protocolo só pode ser aplicado como referência para a situação real que ocorre em plantas no campo, devido às complexas condições ambientais. Além disso, como diferentes calos vegetais exibem diferentes habilidades metabólicas, os metabólitos identificados de xenobióticos podem variar com o tipo de calo.
Conhecer a transformação metabólica de produtos químicos em plantas é importante para seu desenvolvimento e aplicação seguros. O método aqui proposto é eficiente e confiável para a triagem dos metabólitos gerados em plantas, e pode apoiar a avaliação do risco associado aos ecossistemas e à saúde humana por meio da transferência da cadeia alimentar ou do consumo dietético direto das culturas. Este protocolo pode investigar a persistência de xenobióticos em plantas e ajudar a selecionar contaminantes emergentes. Considerando sua plena capacidade metabólica, com menos custos e diminuição de tempo e esforço, a cultura de calos vegetais é uma boa ferramenta para comparar os comportamentos metabólicos de muitos compostos e construir um banco de dados para a predição de possíveis metabólitos de xenobióticos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21976160) e pelo Projeto de Pesquisa de Aplicação de Tecnologia de Bem-Estar Público da Província de Zhejiang (LGF21B070006).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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