Normalização nascido para Tomografia Projeção de fluorescência óptica para imagens de todo o coração

Para realizar a tomografia de projeção óptica normalizada, a amostra é primeiro fixada e embutida em um cilindro de agarose. Em seguida, a amostra é rotacionada ao longo de um eixo vertical e iluminada uniformemente com um comprimento de onda de excitação, sendo a transmissão medida com um C, CD e óptica adequada. O sinal fluorescente no comprimento de onda é medido em modo de transiluminação.

As imagens fluorescentes e de absorção adquiridas são utilizadas para determinar a razão de Born normalizada e reconstruir a distribuição dos fluoróforos dentro da amostra. Olá, meu nome é Claudia Naone e trabalho nos Centros de Biologia de Sistemas do Hospital Geral de Massachusetts, Escola Médica de Harvard. Sou Danielle Raki, do Instituto de Imagem Biológica e Médica da Universidade Técnica de Munique e do Centro Al Munich.

Eu sou Giselle Fido. Sou diretora do Experimental su Co aqui no C-M-I-C-S-B, Hospital Geral de Massachusetts, Escola Médica de Harvard. Hoje mostraremos a você um procedimento para imagem em tempo real de órgão inteiro ex vivo utilizando a abordagem normalizada por Born para tomografia por projeção óptica.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a distribuição de sondas moleculares fluorescentes em órgãos ocos. Então, vamos começar. Este vídeo explicará o procedimento para utilizar a tomografia por projeção óptica para obter imagens de tecidos ou órgãos preparados e um vídeo complementar.

Explicamos como usar este sistema para realizar imagens com lapso de tempo em drosófila em desenvolvimento. A técnica de imagem tridimensional de tomografia por projeção óptica exige uma combinação única de óptica e uma plataforma rotatória. Neste segmento do vídeo, o procedimento de imagem será elucidado.

Para começar, a fonte de luz primária atua como fonte tanto para medições de iluminação quanto de absorção, e para fornecer excitação fluorescente em medições de fluorescência, a fonte de luz primária é inicialmente filtrada com um filtro de interferência de banda estreita. Em seguida, a luz passa por um conjunto de filtros neutros densos fixos e variáveis. Estes são combinados com a presença de um obturador automático para controlar a quantidade de luz na amostra e mantê-la baixa o suficiente para evitar qualquer fotoesbranquecimento.

A iluminação uniforme da amostra é obtida utilizando um expansor de feixe e uma lente telescópica glan combinada com uma lente difusora. Por fim, filtros ópticos de interferência de banda estreita são utilizados para purificar opticamente a luz da fonte de excitação. A amostra é imersa em uma solução clareadora e mantida no lugar para aquisição de imagens dentro de um tubo de vidro.

A amostra é rotacionada ao longo de seu eixo vertical por meio de uma plataforma de rotação de alta velocidade com precisão absoluta de 0,05 graus. Três controladores manuais distintos permitem que o eixo vertical da amostra seja inclinado e ajustado em seu plano ortogonal. O sinal absorvente é adquirido em iluminação transmitida e é detectado diretamente por uma câmera CCD.

O sinal fluorescente é filtrado por meio de um filtro de interferência de banda estreita, combinado com um filtro de longa passagem, e então coletado com uma lente telecêntrica. As lentes tele oferecem a vantagem de fornecer características únicas que as tornam ideais para tomografia por projeção óptica.

A presença de uma abertura localizada dentro do conjunto da lente no ponto focal da lente é fundamental. Ela garante que a imagem se propague paralelamente ao eixo óptico. Isso elimina a distorção de perspectiva e fornece ampliação uniforme em diversos planos focais dentro da profundidade telecêntrica.

O próximo segmento do vídeo descreve uma técnica para preparar amostras. Em seguida, será apresentada a metodologia utilizada para a obtenção de imagens. O preparo do tecido ou órgão amostral para imagem tomográfica baseia-se em uma desidratação com etanol que evita retração assimétrica.

Esse processo leva vários dias para ser concluído. Neste vídeo, um coração de camundongo é preparado, mas o protocolo pode ser aplicado a qualquer tecido ou órgão. Demonstraremos nosso método de imagem de fluorescência utilizando o coração de um animal que sofreu um infarto controlado.

Em outras palavras, uma perda do suprimento sanguíneo levando à necrose tecidual evidente previamente. O camundongo foi injetado com pro desde seis 80 em um sensor fluorescente inativo que relata a atividade da cathepsina na cicatrização. Anestesiar o miocárdio do camundongo para perfusão e extração do coração por meio de uma injeção intraperitoneal de ketamina e xilazina. Em seguida, injetar 50 unidades de heparina por via intraperitoneal para prevenir a coagulação.

Cinco minutos depois, realize a laparotomia longitudinal no animal completamente anestesiado para remover o sangue. Primeiro, abra a veia renal esquerda. Agora, injete lentamente 20 mililitros de solução salina na veia cava inferior.

A solução salina desloca o sangue após a lavagem completa do sangue sob um microscópio estereoscópico. Continue utilizando os métodos operacionais padrão para abrir a caixa torácica e remover o coração. Agora, fixe o coração por oito horas em PFA 4% a quatro graus Celsius.

A partir deste ponto, os passos de preparação do tecido devem ser realizados no escuro para evitar o desbotamento de agentes de contraste fluorescentes ou proteínas aplicados ao tecido. Quando a fixação estiver completa, remova o PFA com uma lavagem de 15 minutos em PBS; em seguida, o coração limpo é embutido em uma camada de agarose a 0,8%. Após a secagem da agarose, esta é cortada ao redor do tecido para formar um bloco.

Em seguida, desidrate o coração aros criptografado por meio de uma série de cinco etapas, começando com imersão em Etanol 20%, seguida por concentrações progressivamente maiores de etanol e, por fim, etanol puro. Esse procedimento de desidratação ajuda a evitar qualquer contração assimétrica da amostra. Os primeiros quatro banhos em etanol diluído devem ser realizados por uma hora, e o banho final em Etanol 100% deve ser realizado por pelo menos 10 horas.

Após a conclusão dos tratamentos com etanol, coloque a amostra na solução de Murray até que a amostra fique transparente, o que pode variar de algumas horas a vários dias. Essa solução clareadora imita a água celular e possui índice de refração semelhante ao das membranas celulares, tornando o tecido transparente. Traços mínimos de etanol podem estar presentes ao final do processo de clareamento, gerando diversos artefatos nas reconstruções devido ao movimento térmico do álcool dentro da própria solução clareadora.

Para evitar esse problema, recomenda-se um segundo ciclo de clareamento. Este não deve levar mais de quatro horas. Após concluído, a amostra está pronta para a projeção óptica.

Tomografia com a ajuda de um computador. A reconstrução da absorção óptica na ausência de espalhamento da luz pode ser obtida utilizando um algoritmo comum de retroprojeção de Radon filtrado. Esse processo é análogo à tomografia computadorizada de raios X bidimensional.

Coloque o bloco de aeros na câmara de imagem transparente preenchida com a solução de clareamento. Agora, monte a câmara sobre a platina e ilumine a amostra com um feixe colimado para medições de excitação e transmissão. A escolha da fonte de excitação depende da proteína fluorescente ou do agente de contraste molecular de imagem escolhido.

É conveniente alinhar o eixo vertical da amostra paralelamente à coluna de pixels do CCD. Gire a amostra em 360 projeções usando incrementos angulares de um grau, adquirindo imagens em cada ângulo em transiluminação nos comprimentos de onda de absorção e de fluorescência. O software que controla a aquisição gerencia automaticamente o obturador da fonte de luz primária para evitar iluminação contínua e reduzir o branqueamento fotônico da amostra.

O obturador é especialmente importante quando são necessários tempos longos de integração para criar uma reconstrução 3D a partir dos dados de absorção. Basta utilizar um algoritmo de retroprojeção de Radon com filtro para a reconstrução 3D a partir das imagens fluorescentes. Outras contribuições de absorção devem ser levadas em conta, as quais são descritas no próximo segmento do vídeo.

Após concluir as etapas necessárias para uma reconstrução de absorção, existem mais algumas etapas para finalizar uma reconstrução fluorescente. A reconstrução de um mapa óptico na ausência de espalhamento de luz pode ser obtida utilizando um algoritmo comum de retroprojeção de radon com filtro. O processo é análogo à tomografia computadorizada de raios X bidimensional.

Ao reconstruir a distribuição de fluorescência, a absorção variável dependente do espaço torna incorreto o uso da transformada inversa de Radon para a retroprojeção das imagens de fluorescência, afetando severamente as distribuições obtidas de proteínas fluorescentes ou sondas moleculares fluorescentes e sua capacidade de quantificação. Cada raio no comprimento de onda de excitação Lambda X, emitido a partir de uma posição arbitrária da fonte Xs, é atenuado exponencialmente ao atravessar o objeto imageado.

Após a excitação, o fluorocromo localizado na posição X emite radiação que é filtrada e coletada pelo pixel do CCD localizado na posição XD, utilizando o sistema de lentes de imagem Teleric. Embora a fluorescência emitida não siga o mesmo trajeto do raio de excitação, a intensidade registrada em cada pixel aproxima-se de uma projeção de todos os fluorocromos excitados ao longo de toda a zona focal correspondente a esse raio de excitação específico. Devido à alta telecentricidade do sistema, o objeto imageado é então girado 360 graus e múltiplas medições entre fonte e detector, UX no comprimento de onda de excitação e UFL no comprimento de onda de emissão, são adquiridas com a câmera CCD.

Estes são então combinados sob o campo normalizado de Born UB, definido como a razão entre os dois. A reconstrução da distribuição do fluorocromo pode ser facilitada pela escrita do modelo direto para a propagação da luz de excitação e emissão, sendo a função de Green que descreve a excitação. A propagação dos raios segue uma simples lei de Beer-Lambert, onde μa é a distribuição de absorção óptica previamente determinada.

A intensidade luminosa UX emitida pela fonte na posição Xs e medida pelo detector na posição XD sobre o C.C. D pode ser escrita como o produto da função verde com uma constante B que depende do sistema. A distribuição precisa da intensidade luminosa de excitação GX ao longo de cada trajetória de raio pode então ser calculada. A intensidade de fluorescência UFL detectada no detector XD, estimulada pela luz emitida pela fonte Xs, leva em consideração a contribuição de todos os pontos que foram excitados ao longo da trajetória do raio desde Xs até XD.

O modelo direto do nosso problema de imagem pode então ser escrito como ub ub, onde alfa incorpora as constantes desconhecidas que dependem do sistema. O modelo direto é então discretizado na malha assumida e é realizada uma inversão para extrair a distribuição do fluoróforo, adquirir tanto o sinal de transmissão quanto o sinal fluorescente e utilizar o algoritmo convencional de retroprojeção para reconstruir a amostra. Aqui, são apresentados os reconstruções de tomografia óptica de projeção por transmissão e por fluorescência convencional.

Uma reconstrução de um único plano do coração é mostrada tanto em absorção quanto em fluorescência. A reconstrução normalizada de Born é apresentada e mostra a diferença na distribuição do corante dentro do coração. Após a normalização, mostramos como configurar a tomografia por projeção óptica e como remover artefatos devidos à absorção óptica nas reconstruções da tomografia de fluorescência.

Na verdade, é muito importante ter em mente a necessidade de clarear a amostra para remover a contribuição da luz dispersa, mas, ao mesmo tempo, também é importante equilibrar o processo de clareamento para manter, o máximo possível, a contribuição da fluorescência. Outra coisa muito importante a lembrar ao usar esta abordagem é calcular a razão normalizada do osso, obtida dividindo as imagens de fluorescência pelas de absorção. É isso aí.

Obrigado por participar do nosso experimento visualizado e boa sorte com seus próprios experimentos.