Normalização nascido para Tomografia Projeção de fluorescência óptica para imagens de todo o coração

Para realizar a tomografia de projeção óptica de nascimento normalizado, a amostra é primeiro fixada e embutida em um cilindro de trado. A amostra é então girada ao longo de um eixo vertical e, em seguida, uniformemente iluminada com um comprimento de onda de excitação, e a transmissão é medida com uma óptica adequada C, CD. O sinal fluorescente no comprimento de onda é medido no modo de transiluminação.

As imagens fluorescentes e de absorção adquiridas são usadas para determinar a razão de nascidos normalizada e reconstruir a distribuição de quatro fluorados dentro da amostra. Olá, meu nome é Claudia Naone e trabalho nos Centros de Biologia de Sistemas do Mass General Hospital, Harvard Medical School. Sou Danielle Raki do Instituto de Imagens Biológicas e Médicas da Universidade Técnica de Munique e do Al Center Munich.

Eu sou Giselle Fido. Eu sou o diretor da Experimental su Co aqui no CMICSB, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Hoje mostraremos um procedimento para imagens de órgãos inteiros ex vivo em tempo real usando a abordagem normalizada de Born para tomografia de projeção óptica.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a distribuição de sondas moleculares de fluorescência em órgãos ocos. Então vamos começar. Este vídeo explicará o procedimento para usar a tomografia de projeção óptica para obter imagens de tecidos ou órgãos preparados e um vídeo que o acompanha.

Explicamos como usar este sistema para realizar imagens de lapso de tempo no desenvolvimento de drosófila. A técnica de imagem tridimensional da tomografia de projeção óptica requer uma combinação única de óptica e um estágio rotativo. Neste segmento do vídeo, o procedimento de imagem será elucidado.

Para começar, a fonte de luz primária serve como fonte para medições de iluminação e absorção e, para fornecer excitação fluorescente para medições de fluorescência, a fonte de luz primária é primeiro filtrada com um filtro de interferência de passagem de banda estreita. Em seguida, a luz passa por um conjunto de filtros de densidade neutra fixa e variável. Estes são combinados com a presença de um obturador automático para controlar a quantidade de luz na amostra e mantê-la baixa o suficiente para evitar qualquer branqueamento fotográfico.

A iluminação uniforme da amostra é obtida usando um expansor de feixe e uma lente de telescópio de glan combinada com uma lente difusora. Finalmente, filtros ópticos de interferência de passagem de banda estreita são usados para limpar opticamente a luz da fonte de excitação. A amostra é imersa em uma solução de limpeza e mantida no lugar para geração de imagens dentro de um tubo de vidro.

A amostra é girada ao longo de seu eixo vertical por meio de um estágio de rotação de alta velocidade com uma precisão absoluta de 0,05 graus. Três controladores manuais distintos permitem que o eixo vertical da amostra seja inclinado e ajustado em seu plano ortogonal. O sinal absorvente é adquirido na iluminação trans e é detectado diretamente por uma câmera CCD.

O sinal fluorescente é filtrado através de um filtro de interferência passa-banda estreita, acoplado a um filtro passa-longo e é então coletado com uma lente telecêntrica. As lentes tele oferecem a vantagem de fornecer recursos exclusivos que as tornam ideais. Para tomografia de projeção óptica.

A presença de um batente de abertura localizado dentro do conjunto da lente no ponto focal da lente é fundamental. Ele garante que a imagem viaje paralelamente ao eixo óptico. Isso elimina a distorção de perspectiva e fornece ampliação igual em muitos planos focais dentro da profundidade telecêntrica.

O próximo segmento de vídeo descreve uma técnica para preparar amostras. Isso será seguido pela metodologia usada para imagens. A preparação do tecido ou órgão da amostra para imagens tomográficas depende de uma desidratação à base de etanol da amostra que evita o encolhimento assimétrico.

Esse processo leva muitos dias para ser concluído. Neste vídeo, um coração de camundongo é preparado, mas o protocolo pode ser aplicado a qualquer tecido ou órgão. Demonstraremos nosso método de imagem de fluorescência usando o coração de um animal que sofreu um infarto controlado.

Em outras palavras, uma perda de suprimento de sangue levando à necrose tecidual óbvia com antecedência. O camundongo foi injetado com pro desde seis sensores fluorescentes de 80 inatos relatando a atividade da catepsina na cicatrização. O miocárdio anestesia o camundongo para perfusão e extrusão cardíaca usando uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina Em seguida, injete 50 unidades de heparina intraperitoneal para evitar a coagulação.

Cinco minutos depois, realizar a laparotomia longitudinal no animal totalmente anestesiado para remover o sangue. Primeiro, abra a veia renal esquerda. Agora injete lentamente 20 mililitros de solução salina na veia cava inferior.

A solução salina desloca o sangue depois de lavar todo o sangue sob um microscópio de dissecação. Continue usando métodos operacionais padrão para abrir o tórax e remover o coração. Agora, fixe o coração por oito horas em 4% PFA a quatro graus Celsius.

Deste ponto em diante, as etapas de preparação do tecido devem ser realizadas no escuro para evitar o branqueamento de quaisquer agentes de contraste fluorescentes ou proteínas aplicadas ao tecido. Quando a fixação estiver completa, lave o PFA com um enxágue de 15 minutos em PBS, o coração limpo é então incorporado em uma poça de 0,8% aros. Depois que o aros seca, a agarose é cortada ao redor do tecido para fazer uma forma de bloco.

Em seguida, desidrate o coração criptografado aros por meio de uma série de cinco etapas de imersão em 20% de etanol, depois concentrações progressivamente mais altas de etanol e, finalmente, etanol puro. Este procedimento de desidratação ajuda a evitar qualquer encolhimento assimétrico da amostra. Os primeiros quatro banhos em etanol diluído devem ser realizados por uma hora e o banho final em etanol 100% deve ser realizado por pelo menos 10 horas.

Quando os tratamentos com etanol estiverem concluídos, coloque a amostra na solução transparente de Murray até que a amostra claire, o que varia de algumas horas a vários dias. Esta solução de limpeza imita a água celular e o índice corresponde às membranas celulares, tornando o tecido transparente. O etanol em traços mínimos pode estar presente no final do processo de limpeza, dando origem a vários artefatos nas reconstruções devido ao movimento térmico do álcool dentro da própria solução de limpeza.

Para evitar esse problema, recomenda-se um segundo ciclo de limpeza. Isso não deve demorar mais de quatro horas. Depois de concluída, a amostra está pronta para projeção óptica.

Tomografia com o auxílio de um computador. A reconstrução da absorção óptica na ausência de dispersão de luz pode ser obtida usando um algoritmo comum de retroprojeção de radônio filtrado. Este processo é análogo à tomografia computadorizada de raios-x bidimensionais.

Coloque o bloco de aeros na câmara de imagem transparente preenchida com a solução de limpeza. Agora monte a câmara no palco, ilumine a amostra com um feixe agrupado para medições de excitação e transmissão. A escolha da fonte de excitação é baseada na proteína fluorescente escolhida ou no agente de contraste de imagem molecular.

É conveniente alinhar o eixo vertical da amostra paralela à coluna de pixels do CCD. Gire a amostra em 360 projeções usando incrementos angulares de um grau, adquira imagens em cada ângulo em iluminação trans nos comprimentos de onda de absorção e fluorescência. O software que executa a aquisição controla automaticamente o obturador na fonte de luz primária para evitar iluminação contínua e reduzir o branqueamento da foto da amostra.

O obturador é especialmente importante quando são necessários longos tempos de integração para criar uma reconstrução 3D a partir dos dados de absorção. Basta usar um algoritmo de retroprojeção de radônio filtrado para reconstrução 3D a partir das imagens fluorescentes. Outras contribuições de absorção devem ser levadas em consideração, que são descritas no próximo segmento de vídeo.

Depois de concluir as etapas necessárias para uma reconstrução por absorção, há mais algumas etapas para concluir uma reconstrução fluorescente. A reconstrução de um mapa óptico na ausência de espalhamento de luz pode ser obtida usando um algoritmo comum de retroprojeção de radônio filtrado. O processo é análogo à tomografia computadorizada de raios-x bidimensionais.

Ao reconstruir a distribuição de fluorescência. A absorção espacialmente dependente variável torna incorreto o uso do radônio inverso para trás, projetando as imagens de fluorescência afetando severamente as distribuições de proteína fluorescente ou sonda molecular fluorescente obtidas e sua capacidade de quantificação. Cada raio no comprimento de onda de excitação Lambda X que é emitido a partir de uma posição de fonte arbitrária Xs, é exponencialmente atenuado à medida que passa pelo objeto fotografado.

Após a excitação, o fluorocromo localizado na posição X, a radiação no comprimento de onda de emissão é filtrada e coletada pelo pixel CCDs localizado na posição XD usando o sistema de lentes de imagem Teleric. Embora a fluorescência emitida não siga o mesmo caminho que o raio de excitação, a intensidade registrada em cada pixel se aproxima de uma projeção de todos os fluorocromos excitados ao longo de toda a zona focal correspondente a esse raio de excitação específico. Devido à alta telecentricidade do sistema, o objeto fotografado é então girado 360 graus e as medições do detector de múltiplas fontes, UX no comprimento de onda de excitação e UFL no comprimento de onda de emissão são adquiridas com a câmera CCD.

Estes são então combinados sob o campo nascido normalizado UB definido como a proporção dos dois. A reconstrução da distribuição do cromo fluorado pode ser facilitada escrevendo o modelo direto para excitação e propagação de luz de emissão, a função verde descrevendo a excitação. A propagação de raios segue uma lei simples de Lambert da cerveja, onde moo A é a distribuição de absorção óptica previamente determinada.

A intensidade da luz UX emitida pela fonte na posição excedente e medida pelo detector na posição XD no CC, D pode ser escrita como o produto da função verde com uma constante B que depende do sistema. A distribuição precisa da intensidade da luz de excitação GX ao longo de cada caminho de raio pode então ser calculada. A intensidade de fluorescência UFL detectada no detector XD que é estimulada pela luz emitida pela fonte Xs leva em consideração a contribuição de todos os theros que foram excitados ao longo do caminho do raio de X a xd.

O modelo direto do nosso problema de imagem pode então ser escrito como ub ub, onde alfa incorpora as constantes desconhecidas que dependem do sistema. O modelo direto é então discretizado na malha assumida e uma inversão é realizada para extrair a distribuição do fluorocromo, adquirir a transmissão e o sinal fluorescente e usar o algoritmo convencional de retroprojeção para reconstruir a amostra. Aqui, são mostradas as reconstruções de transmissão e tomografia de projeção óptica de fluorescência convencional.

Uma reconstrução de um único plano do coração é mostrada tanto na absorção quanto na fluorescência. A reconstrução de nascimento normalizado é apresentada e mostra a diferença na distribuição do corante dentro do coração. Após a normalização, acabamos de mostrar como ser a configuração para tomografia de projeção óptica e como remover artefatos devido à absorção óptica nas reconstruções para tomografia de fluorescência.

Na verdade, é muito importante ter em mente limpar a amostra para remover a contribuição da luz espalhada, mas, ao mesmo tempo, também é importante equilibrar o processo de limpeza para manter o máximo possível da contribuição de fluorescência. Outra coisa que é muito importante lembrar ao usar essa abordagem é calcular a razão normalizada óssea que é obtida dividindo as imagens de fluorescência pelas de absorção. Então é isso.

Obrigado por participar de nosso experimento visualizado e boa sorte com seus próprios experimentos.