Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis
28 de dezembro de 2009
Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.
A manipulação da função celular pode ser alcançada por meio das abordagens clássicas de transfeção de DNA ou transdução viral nos últimos 15 anos. Outro método se desenvolveu. A proteína biologicamente ativa pode ser diretamente entregue em células de mamíferos utilizando pequenos peptídeos fundidos à proteína de interesse, o que promove a captação celular.
Como nenhum DNA é utilizado, o risco de agênese por esforço é evitado. Em contraste com os métodos clássicos mencionados acima, a transdução proteica permite a entrega de proteínas de maneira titulável.
Além disso, pequenas populações celulares, bem como células não divididas, como neurônios pós-mitóticos, podem ser moduladas. Para expressar proteínas recombinantes de maneira eficiente, recomendamos o uso do sistema de vetor Paciz. Trata-se de um sistema modular de vetores composto por uma variante terminal N e uma variante terminal C.
Os dois vetores permitem a inserção fácil do seu gene de interesse para fins de purificação. Uma marcação de histidina é integrada, bem como um domínio de transdução proteica. No nosso caso, o toque do vírus HI promove a captação celular para distribuição intracelular.
Um sinal de localização nuclear completa o vetor por razões de controle, e as marcas de fusão podem ser simplesmente removidas. Além disso, a disposição dessas marcas pode ter grande influência sobre as propriedades das proteínas de fusão. A influência sobre o rendimento e a pureza, bem como sobre a comercialização e a função biológica, não é previsível.
Olá, meu nome é Bernard Mus e trabalho no grupo de Engenharia de Células-Tronco do Instituto de Neurobiologia Reconstitutiva em Bonn, Alemanha. Olá, meu nome é Christoph P e também sou membro do Laboratório Hoover. Nosso grupo utiliza intensivamente a técnica de transdução proteica para entregar diretamente proteínas biologicamente ativas em diversas células de mamíferos, e hoje vamos orientá-lo pelo processo de expressão e purificação em e a partir de e coli.
Posteriormente, gostaríamos de mostrar como aplicar a proteína de fusão celular permanente em cultura celular para exemplificar todo o procedimento de expressão, purificação e aplicação. Utilizamos a recombinase Cre específica de sítio para modificar geneticamente células-tronco embrionárias de camundongo. Ok. Ok. Vamos começar.
Para inocular a cultura de crescimento noturno, utilizamos bactérias previamente transformadas armazenadas em estoque de glicerol a menos 80 graus centígrados. Essas bactérias já contêm o vetor que codifica a recombinação decre. Usando uma ponteira de pipeta, raspamos uma pequena quantidade das bactérias na ponteira e a adicionamos ao béquer contendo a cultura de crescimento noturno.
A cultura de crescimento noturno consiste em meio LB suplementado com glicose numa concentração final de 0,5% e 50 microgramas de insulina carbônica por ml. Em seguida, o béquer é colocado em um incubador a 37 graus centígrados para a expressão do Recombinate Cree específico ao sítio. Estamos utilizando meio TB pré-aquecido para a cultura de expressão em larga escala.
Para acelerar a expressão, recomendamos o uso de meio TB aquecido a 37 graus centígrados, que representa a temperatura durante a expressão da proteína recombinante. Em seguida, adicionamos glicose ao meio TB numa concentração final de 0,5%. A glicose impede um aumento na expressão basal da proteína de fusão durante o crescimento da cultura de expressão antes da indução. Por fim, a ampicilina é adicionada à cultura de expressão numa concentração final de 100 microgramas por ml para assegurar uma cultura pura contendo apenas as bactérias que ainda possuem o plasmídeo que codifica a proteína decree.
Agora podemos obter nossa cultura de crescimento noturno e inocular a cultura de expressão na proporção de um para 50. Os béqueres são então transferidos para um incubador operando à temperatura de 37 centígrados. Você deve coletar amostras para medir a densidade óptica em intervalos regulares durante toda a expressão.
Assim que o cultivo atingir uma densidade óptica de 1,5, as bactérias são induzidas com uma concentração final de 0,5 milimolar de IPTG. Após uma hora de indução, o cultivo de expressão é transferido para tubos e posteriormente colhido por centrifugação. Para esse fim, estamos utilizando um rotor SLA 3000.
A centrífuga está funcionando a uma velocidade de 5.000 rotações por minuto durante 10 minutos a quatro graus Celsius. O sobrenadante então é descartado e o pellet bacteriano pode ser armazenado indefinidamente a menos 20 graus centígrados. Os pellets congelados são ressuspendidos em tampão lizza, um volume equivalente a um litro de cultura de expressão.
Utilizamos 10 mL de tampão lizza e aguardamos aproximadamente 15 minutos até a solução ficar homogênea. Em seguida, adiciona-se um miligrama de lisozima por cada mL de suspensão. A solução é misturada durante 20 minutos para permitir que a enzima rompa as bactérias.
Posteriormente, é adicionado Benson Nase em uma diluição de um para 1000 por mais 15 minutos, o que cortará o DNA, resultando em uma solução não viscosa. Finalmente, um sonador é usado para garantir a lise das células. O programa é executado por um minuto e meio com uma potência de 45% após a conclusão da certificação.
Lembre-se de coletar uma amostra de cada etapa aqui, o lisado bruto ou a análise em gel SDS-PAGE da purificação. Agora é realmente importante adicionar um mL de tampão TSB gelado por mL de suspensão, pois a proteína decree tenderá a precipitar no estoque de glicerol. Se você for pular esta etapa, misture a solução brevemente e o material bruto estará pronto para centrifugação.
Para esse fim, utilizamos um rotor SS 34. A centrífuga opera a 17.000 RPM durante 30 minutos a quatro graus centígrados. Ao finalizar, o sobrenadante S é cuidadosamente transferido para tubos Falcon frescos de 50 ml.
Agora, adicione a suspensão de níquel anti A ao sobrenadante contendo níquel. O anti A é um reagente essencial para a purificação adequada das proteínas de fusão com marcação de histidina. A histidina forma um complexo com os íons de níquel, permitindo a purificação por afinidade; agora, agite suavemente os tubos em repouso por 60 minutos a 40 graus Celsius.
Após uma hora, você já pode aplicar a suspensão em colunas de 20 mL e deixar a solução passar por fluxo gravitacional. Para produções em larga escala, é viável dividir a suspensão em várias colunas. Em seguida, lavamos a coluna duas vezes com um tampão contendo 15 milimolares de innersole.
A quantidade de tampão aplicada depende do volume da resina. Dois MLS de níquel NTA correspondem a um ml de resina para fins de lavagem. Adicionamos cinco volumes da resina de tampão de lavagem na coluna; após a lavagem, estamos agora prontos para eluir nossa proteína.
Portanto, utilizamos um tampão de eluição com uma concentração de 250 milimolar de imimo. Observe como a cor da resina muda para o verde. Devido às altas concentrações da proteína CRE, a fração OID às vezes fica escura.
Para evitar isso, misture a solução e adicione tampão de lise adicional; todas as frações agora são reunidas e subsequentemente transferidas para um tubo de diálise. A lise removerá o ole. O primeiro passo de diálise é realizado contra o tampão contendo uma alta concentração de sal. Após uma hora, o tampão com alto teor de sal é substituído e o procedimento de diálise é aplicado durante a noite.
No dia seguinte, o tubo de diálise é retirado do tampão com alto teor salino e transferido para um tampão de glicerol. Após três a cinco horas, o tampão de glicerol é substituído e a diálise é novamente realizada durante a noite. A lise em tampão de glicerol resultará em uma solução estoque concentrada em pelo menos três vezes.
A solução estoque pode agora ser armazenada a menos 20 graus centígrados por vários anos sem perda de atividade. Para garantir a qualidade, você pode carregar as amostras coletadas de SDS-PAGE em um gel e posteriormente corá-lo. Para Kamasi, a proteína de fusão Cree é detectável como uma faixa proeminente na fração OID. Para utilizar a concentração apropriada de recombinação Crew, você deve determinar a concentração por meio do ensaio de Redford.
Como aplicar proteínas permanentes em células de mamíferos. Primeiramente, prepare suas células-alvo para alcançar as maiores eficiências de transdução proteica. Observe células em monocamada na densidade que resultará em uma camada celular com 80 a 90% de confluência no dia seguinte, caso suas células-alvo sejam células yes, cultivadas em colônias compactas.
Se pare as células somáticas e observe-as em suspensão simples de células com cinco horas de antecedência. É importante obter uma suspensão simples de células antes da transdução proteica, pois, caso contrário, apenas as células aéreas na superfície de uma colônia poderão ser transfundidas. Aspire o meio e lave brevemente as células aéreas com PPS antes do tratamento.
Remova o meio grosso restante contendo soro. Após aspirar as células com a sobreposição de PPS gota a gota, deixe-as incubarem por três a cinco minutos. Agora, verifique ao microscópio se todas as colônias se dissolveram em células isoladas.
Devido às razões mencionadas anteriormente, esta é uma etapa crucial para a transdução proteica em células yes. Transfira as células destacadas para um tubo. Coloque o tubo em uma centrífuga e centrifugue para sedimentar as células. Aspire o sobrenadante e re-suspenda a célula.
P no meio de crescimento dilua as células para o número apropriado. Isso, é claro, depende do tamanho da cultura de tecidos. Incube as células em placa por mais cinco horas.
Isso dará às células aéreas tempo suficiente para se fixarem no fundo e crescerem aderentes. O estoque de três linhagens pode ser armazenado a menos 20 graus por mais de dois anos. Ao trabalhar com proteína de fusão permanente recombinante, é muito benéfico ter uma solução estoque como essa, que pode ser usada sob demanda.
Enquanto espera as células aderirem à placa, pode-se preparar o meio de transdução C diluindo simplesmente um volume apropriado de proteína de expressão celular permanente a partir do estoque de colesterol no meio. Como a solução estoque de Clare ainda não é estéril, o meio de transdução precisa ser filtrado esterilmente antes de sua aplicação. Recomendamos o uso de uma seringa que possa ser rosqueada em um filtro de ligação de proteína de lobo.
A concentração final de creek depende do tipo celular ou dos suplementos do meio. Por exemplo, o soro exerce uma forte influência negativa na eficiência de transdução. Isso pode ser superado utilizando meio livre de soro ou aumentando a concentração de creek.
Encontramos a condição ideal que permite a maior eficiência de recombinação. Hidrate a concentração do decreto a partir de 0,5 até 10 micromolares. Recomendamos testar diferentes tempos de incubação entre seis e 18 horas.
Após cinco horas de incubação, retire suas células-alvo e aspire o meio cruzado. Posteriormente, substitua-o por meio de transdução proteica e coloque as células de volta no incubador após incubação noturna. Lave brevemente as células D com PPS e substitua o meio de transdução proteica por meio ES normal.
48 horas após a incubação, a expressão gênica permanente da célula Cree pode ser detectada por meio de xul. As células coradas com fenótipo positivo para bega foram geneticamente modificadas com sucesso por meio da recombinação específica de sítio. Cree o relatório.
As células que abrigam a construção CRE-Lae mediante recombinação pré-mediana têm uma sequência de parada flanqueada por P removida, e um gene repórter luxe é ativado sob o controle do promotor team. Para avaliar a eficiência de recombinação em células aéreas repórter pré-tratadas, as células devem ser fixadas.
Aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS, recubra as células com PFA 4% e incube-as por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células mais uma vez três vezes com PBS. Após aspirar o PBS do último passo de lavagem, adicione a solução de coloração Xal aos poços e incube as células durante a noite a 37 graus em um incubador.
No dia seguinte, a atividade Beal pode ser monitorada por meio de células com halo azul. A eficiência de recombinação pode ser determinada pelo número de colônias azuis. Em condições ideais, você deverá ser capaz de alcançar uma eficiência de recombinação superior a 90%. Muito bem, hoje mostramos a vocês como expressar e purificar a recombinação específica de sítio a partir de E. coli.
Neste estudo de prova de princípio, foi possível induzir recombinação na maioria dos sais. Ok, é isso. Boa sorte com seus Experimentos.I.
Visão Geral
Este artigo discute a transdução proteica como um método para entregar proteínas biologicamente ativas diretamente em células de mamíferos. Diferentemente dos métodos tradicionais, como a transfeção de DNA, a transdução proteica é não invasiva e permite a manipulação celular eficiente sem os riscos associados à modificação genética permanente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Engenharia de Proteínas
Antecedentes
- Os métodos clássicos de manipulação celular incluem a transfeção de DNA e a transdução viral.
- A transdução proteica utiliza pequenos peptídeos para aumentar a captação celular de proteínas.
- Este método é particularmente útil para células não divididas, como neurônios pós-mitóticos.
- O sistema vetorial Paciz é recomendado para expressão eficiente de proteínas recombinantes.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o processo de expressão e purificação de proteínas em E. coli.
- Ilustrar a aplicação de proteínas de fusão permeáveis à membrana celular em cultura celular.
- Explorar o uso da recombinação específica de sítio para modificação genética de células-tronco.
Métodos Utilizados
- Inoculação de culturas de crescimento noturno de bactérias transformadas.
- Uso de meio LB e meio TB para expressão proteica.
- Indução da expressão proteica utilizando IPTG.
- Purificação de proteínas utilizando cromatografia de afinidade por níquel.
Resultados Principais
- Expressão bem-sucedida de proteínas recombinantes em E. coli.
- Purificação eficiente de proteínas de fusão com marcação de histidina.
- Demonstração da transdução proteica em células de mamíferos.
- Informações sobre a influência das marcações de fusão nas propriedades das proteínas.
Conclusões
- A transdução proteica é uma alternativa viável aos métodos tradicionais de modificação genética.
- O sistema vetorial Paciz facilita a expressão e purificação eficientes de proteínas.
- São necessárias pesquisas adicionais para otimizar as propriedades das proteínas de fusão para aplicações específicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A transdução proteica permite a entrega direta de proteínas funcionais em células de mamíferos sem modificação genética, oferecendo uma abordagem titulável e reversível para a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Este método auxilia na redução de riscos mecanicistas ao permitir a investigação rápida da função proteica em sistemas relevantes para doenças, incluindo células não divididas, como neurônios. Ele fornece uma plataforma escalonável para o desenvolvimento de ensaios e triagem fenotípica onde ferramentas genéticas são limitadas ou indesejáveis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de proteínas-alvo por meio da entrega direta, apoiando a verificação de hipóteses e a elucidação de vias.
- Valor Operacional: Oferece um sistema titulável para modular a atividade proteica de maneira controlada e dependente da dose.
- Valor Preditivo: Reduz a dependência de artefatos de superexpressão, aumentando a confiança no engajamento do alvo e nos resultados fenotípicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas mensuráveis de forma quantitativa, como eficiência de recombinação, permitindo leituras robustas de ensaios para triagem de compostos ou moduladores.
- Valor Operacional: Utiliza purificação padronizada por meio de marcação com histidina e cromatografia de afinidade com níquel, garantindo reprodutibilidade entre lotes.
- Escalabilidade: Permite expressão em larga escala em E. coli utilizando meio TB e indução com IPTG, facilitando fornecimento consistente de reagentes para campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Entrega recombinase Cre ativa para validar sistemas repórter baseados em loxP, permitindo a avaliação pré-clínica da eficiência de modificação genética.
- Sistema Relevante para Doenças: Efetivo em neurônios pós-mitóticos e células primárias, apoiando a validação de alvos em modelos relevantes para neurologia.
- Redução Mecanística de Riscos: Permite o controle temporal da atividade proteica para distinguir efeitos diretos de mecanismos compensatórios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer uma ferramenta quimicamente induzível e não genética para validação de alvos, conectando a produção de proteínas recombinantes com ensaios celulares funcionais em um formato escalonável.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação orientada por hipóteses da função proteica por meio da entrega direta e da medição da atividade intracelular.
- Triagem: Permite o preparo padronizado e reprodutível de proteínas para triagem com alta confiabilidade de moduladores ou contextos genéticos.
- Análises: Gera leituras funcionais quantitativas (por exemplo, eficiência de recombinação por meio da triagem azul-branca) para comparar condições e orientar a tomada de decisões.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a eficiência de recombinação in vitro com os resultados pré-clínicos de modificação genética em modelos de células-tronco.
- Reutilização Empresarial: O sistema de vetores Paciz e o protocolo de purificação estabelecem uma plataforma reutilizável para produção de diversas proteínas permeáveis a células em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança na validação do alvo ao evitar a integração genômica e permitir a modulação aguda e reversível de proteínas.
- Valor Operacional: Fornece proteína recombinante padronizada e purificada com atividade consistente, reduzindo a variabilidade em ensaios funcionais.
- Valor Estratégico: Aumenta a precisão nas decisões de avanço ou interrupção ao fornecer evidência funcional direta do engajamento do alvo em ambientes celulares complexos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação funcional em tipos celulares não proliferativos relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em expressão e purificação de proteínas recombinantes e em cultura de células de mamífero para ensaios de transdução.
- Depende da infraestrutura de cromatografia de afinidade por níquel e do acesso a IPTG, meio TB e inibidores de protease para a lise.
- Necessita padronização das condições de transdução (por exemplo, concentração da proteína, tempo de incubação) entre diferentes tipos celulares devido à sensibilidade ao soro e à eficiência variável de captação.
- Requer otimização da disposição das marcas de fusão (por exemplo, TAT, NLS, His-tag) para equilibrar solubilidade, rendimento e atividade biológica.
- Limitado pela necessidade de determinar empiricamente a concentração ativa e a duração da incubação para cada proteína-alvo e tipo celular.
