Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis
December 28th, 2009
Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.
A manipulação da função celular pode ser alcançada através das abordagens clássicas de transfecção de DNA ou transdução viral nos últimos 15 anos. Outro método evoluiu. A proteína ativa biológica de transdução de proteínas pode ser entregue diretamente às células de mamíferos usando pequenos peptídeos fundidos à proteína de interesse, o que promove a absorção celular.
Como nenhum DNA é usado, o risco de agenesia por esforço é evitado. Em contraste com os métodos clássicos acima mencionados. A transdução de proteínas permite a entrega de proteínas de maneira titulável.
Além disso, populações de células pequenas, bem como células que não se dividem, como neurônios pós-mitóticos, podem ser moduladas. Para expressar a proteína recombinante de maneira eficiente, recomendamos o uso do sistema vetorial Paciz. É um sistema vetorial modular que consiste em um terminal final e uma variante do terminal C.
Ambos os vetores permitem a fácil inserção do seu gene de interesse para os meios de purificação. Uma marca de histidina é integrada, bem como um domínio de transdução de proteína. No nosso caso, o toque do vírus HI promove a captação celular para distribuição celular.
Um sinal de localização nuclear completa o vetor por razões de controle, as tags de fusão podem ser simplesmente removidas. Além disso, o arranjo dessas tags pode ter grande influência nas propriedades das proteínas de fusão. A influência no rendimento e na pureza, bem como na capacidade de venda e na função biológica, não é previsível.
Olá, meu nome é Bernard Mus e estou trabalhando no grupo de Engenharia de Células-Tronco do Instituto de Neurobiologia Reconstrutiva em Bond, Alemanha. Olá, meu nome é Christoph P e também sou membro do Hoover Lab. Nosso grupo de trabalho explora intensamente a técnica de transdução de proteínas para fornecer proteína ativa biológica diretamente em várias células de mamíferos, e hoje queremos guiá-lo através do processo de expressão e purificação de e para E. coli.
Depois disso, gostaríamos de mostrar como aplicar a proteína de fusão permanente celular em cultura de células para exemplificar todo o procedimento de expressão, purificação e aplicação. Fazemos uso do Cree de recombinação específico do local para modificar geneticamente as células-tronco onicas de camundongos. Ok.Ok. Vamos começar.
Para inocular a cultura durante a noite, usamos bactérias já transformadas armazenadas em um estoque de glicerol a 80 graus centígrados negativos. Essas bactérias já contêm o vetor que codifica a recombinação de decre. Usando uma ponta de gaiteiro, arranhamos uma pequena quantidade da bactéria na ponta do gaiteiro e a colocamos no béquer que contém a cultura durante a noite.
A cultura noturna consiste em meio LB suplementado com glicose na concentração final de oh 0,5% e 50 microgramas de insulina carbônica por ml. O béquer é então colocado em uma incubadora funcionando a 37 graus centígrados para a expressão do Cree Recombinado específico do local. Estamos usando a mídia de TB pré-guerra para nossa cultura de expressão em larga escala.
Para acelerar a expressão, recomendamos o uso de meio TB aquecido até 37 graus centígrados, que representa a temperatura durante a expressão da proteína recombinante. Em seguida, adicionamos glicose ao meio TB em uma concentração final de oh 0,5% A glicose impede um aumento da expressão basal da proteína de fusão durante o crescimento da cultura de expressão antes da indução. Finalmente, a ampicilina é adicionada à cultura de expressão a uma concentração final de 100 microgramas por ml para garantir uma cultura pura contendo apenas as bactérias que ainda abrigam o plasmídeo que codifica a proteína de decreto.
Agora podemos obter nossa cultura noturna e inocular a cultura de expressão na proporção de um para 50. Os béqueres são então transferidos para uma incubadora que funciona à temperatura de 37 graus centígrados. Você deve coletar amostras para medir a densidade óptica regularmente durante toda a expressão.
Assim que a cultura atinge uma densidade óptica de 1,5, as bactérias são induzidas com uma concentração final de oh 0,5 milimolar de IPTG. Após uma hora de indução, a cultura de expressão é transferida para tubos e subsequentemente colhida por centrifugação. Para isso, estamos usando um rotor SLA 3000.
A centrífuga está funcionando a uma velocidade de 5.000 tiros por minuto por 10 minutos a quatro graus anterógrados. O snat então é descartado e o pellet de bactérias pode ser armazenado indefinidamente a menos 20 graus centígrados. Os pellets congelados são ressuspensos em tampão lizza, uma apelação correspondente a um litro de cultura de expressão.
Usamos 10 ml de tampão lizza e esperamos aproximadamente 15 minutos até que a solução fique homogênea. Adiciona-se então um miligrama de lisozima por cada ML de suspensão. A solução é misturada por 20 minutos para permitir que a enzima abra as bactérias.
Posteriormente, Benson Nase é adicionado em uma diluição de um a 1000 por mais 15 minutos, o que cortará o DNA, resultando em uma solução não viscosa. Finalmente, um sonator é usado para garantir a lise das células. O programa está funcionando por um minuto e meio com uma potência de 45% após a conclusão da certificação.
Lembre-se de tirar uma amostra de cada etapa aqui, o lisado bruto ou a análise da página SDS da purificação. Agora é muito importante adicionar um ml de tampão TSB gelado por ML de suspensão, pois a proteína de decreto tenderá a precipitar dentro do estoque de glicerol. Se você for pular esta etapa, a solução será misturada em breve e o bruto estará pronto para centrifugação.
Para isso, usamos um rotor SS 34. A centrífuga está funcionando a 17.000 RPM por 30 minutos a quatro graus centígrados. Quando terminou, a centrífuga Inc transferiu cuidadosamente o sobrenadante S para tubos Falcon novos de 50 ml.
Agora adicione pasta de níquel anti A ao níquel sobrenadante. O Anti A é um reagente crucial para a purificação adequada das proteínas de fusão da tecnologia de histidina. A histidina forma um complexo com os íons de níquel que permitem a purificação de afinidade agora agite suavemente os tubos de estacionamento por 60 minutos a 40 graus centígrados.
Após uma hora, você pode aplicar a suspensão em colunas de 20 ML e permitir que a solução seja executada por fluxo por gravidade. Para produções em grande escala, é viável dividir a suspensão em várias colunas. Em seguida, lavamos a coluna duas vezes com um tampão contendo 15 milimolares de palmilha.
A quantidade de tampão aplicada depende do volume da resina. Dois MLS de níquel NTA correspondem a um ml de resina para meios de lavagem. Colocamos cinco volumes de resina de tampão de lavagem na coluna após a lavagem, agora estamos prontos para iludir nossa proteína.
Portanto, usamos um tampão de eluição com uma concentração de 250 milimolares de imuno. Portanto, observe como a cor da resina muda para verde. Devido às altas concentrações de proteína CRE, a fração OID às vezes fica com cocô.
Para evitar isso, misture a solução e adicione um tampão de lise adicional, todas as frações agora estão sendo agrupadas e posteriormente transferidas para um tubo de lise. A lise removerá a primeira etapa do dialisador é realizada contra o tampão contendo uma alta concentração de sal. Após uma hora, o tampão com alto teor de sal é trocado e o procedimento de diálise é aplicado durante a noite.
No dia seguinte, o tubo de diálise é retirado do tampão com alto teor de sal e transferido para um tampão de glicerol. Após três a cinco horas, o tampão glicerol é trocado e as diálises são novamente realizadas durante a noite. A lise contra o tampão glicerol resultará em uma solução estoque concentrada pelo menos três vezes.
A solução estoque agora pode ser armazenada a menos 20 graus centígrados por vários anos sem perda de atividade Para garantia de qualidade, você pode carregar suas amostras de página SDS coletadas em um gel e corá-lo posteriormente. Para Kamasi, a proteína de fusão Cree é detectável como uma banda proeminente na fração OID. Para usar a concentração apropriada de recombinação da tripulação, você deve determinar a concentração por meio do ensaio de Redford.
Como aplicar proteínas tão permanentes em células de mamíferos. Em primeiro lugar, prepare suas células-alvo para obter as mais altas eficiências de transdução de proteínas. Veja as células de monocamada na densidade resultante na camada de células de confluência de 80 a 90% no dia seguinte, caso suas células-alvo sejam células yes, que são cultivadas em colônias compactas.
Separe as células e somaticamente e veja-as em uma única suspensão celular com cinco horas de antecedência. É importante fazer uma única suspensão celular antes da transdução de proteínas, caso contrário, apenas as células aéreas na superfície de uma colônia podem ser transfundidas. Aspire a mídia e observe as células de ar brevemente com PPS antes de tentar o tratamento.
Remova o restante Sim, meio bruto contendo soro. Depois de aspirar as células de sobreposição PPS com gotejamento e deixá-las incubar três a cinco minutos. Agora verifique com o microscópio se todas as colônias estão dissolvidas em células únicas.
As razões que acabamos de mencionar, este é um passo crucial para a transdução de proteínas em células yes. Transfira as células destacadas para um tubo. Coloque o tubo em uma mesa, centrifugue e gire as células para baixo, aspire o superagente e ressuspenda a célula.
P em meios de crescimento diluem as células em um número de células apropriado. Isso, é claro, depende do tamanho da cultura de tecidos. Incube as células de ar por mais cinco horas.
Isso dará às células de ar tempo suficiente para se fixarem no fundo e crescerem aderentes. O estoque de três fileiras de classe pode ser armazenado a menos 20 graus por mais de dois anos. Ao trabalhar com proteína de fusão permanente de células recombinantes, é muito benéfico ter uma solução de estoque que possa ser usada sob demanda.
Enquanto espera que as células se liguem ao prato, pode-se preparar o meio de transdução C simplesmente diluindo um volume apropriado de proteína de fluência permanente da célula do estoque de colesterol em si mesmo. Mídia. Como a solução estoque de Clare ainda não é estéril, a mídia trans deve ser filtrada estéril antes de sua aplicação. Recomendamos o uso de uma seringa que possa ser aparafusada em um filtro de ligação à proteína do lóbulo.
A concentração final do riacho depende do tipo de célula ou suplementos de meio. Por exemplo, o soro tem uma forte influência negativa na eficiência da transdução. Isso pode ser superado usando meio livre de soro ou por um aumento da concentração de riacho.
Encontramos a condição ideal que permite a mais alta eficiência de recombinação. Concentração de decreto de hidrato a partir de oh 0,5 até 10 micromolar. Recomendamos testar diferentes tempos de incubação entre seis e 18 horas.
Após cinco horas de incubação, retire as células-alvo e aspire os meios cruzados. Posteriormente, substituímo-lo por meios de transdução de proteínas, colocamos as células de ar de volta na incubadora após a incubação durante a noite. Lavou brevemente as células D com PPS e mudou o meio de transdução de proteínas para meio ES normal.
48 horas após a incubação da expressão gênica permanente do Cree vent celular pode ser detectada via xul. As células de coloração com fenótipo bega positivo foram geneticamente modificadas com sucesso pela recombinação específica do local. Cree o relatório.
As células abrigam a construção de Lae do uso de CRE após a recombinação pré-mediada. Uma sequência de parada de flanco P de bloqueio é extirpada e um gene repórter de luxo é ativado impulsionado pelo promotor da equipe. Para avaliar a eficiência da recombinação em células de ar repórter pré-tratadas, as células devem ser corrigidas.
Aspire as células de lavagem de mídia duas vezes com células de sobreposição de PBS com 4% de PFA e incube as células por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, lave as células mais uma vez três vezes com PBS. Após aspirar o PBS da última etapa de lavagem na solução Xal Stain para os poços, incubar as células durante a noite a 37 graus em uma incubadora.
No dia seguinte, a atividade de Beal pode ser monitorada por células de colarinho azul. A eficiência da recombinação pode ser determinada pelo número de colônias azuis. Em condições ideais, você deve ser capaz de alcançar uma eficiência de recombinação superior a 90%Tudo bem, hoje mostramos como expressar e purificar a recombinação de consulta específica do site De e coli.
Neste estudo de prova de princípio, fomos capazes de induzir a recombinação na maioria dos sais. Ok, é isso. Boa sorte com seus Experiments.I.
Visão Geral
Este artigo discute a transdução de proteínas como um método para entregar proteínas biologicamente ativas diretamente em células de mamíferos. Diferentemente dos métodos tradicionais, como a transfecção de DNA, a transdução de proteínas é não invasiva e permite a manipulação celular eficiente sem os riscos associados à modificação genética permanente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Engenharia de Proteínas
Contexto
- Os métodos clássicos para manipulação celular incluem transfecção de DNA e transdução viral.
- A transdução de proteínas utiliza pequenos peptídeos para melhorar a captação celular de proteínas.
- Este método é particularmente útil para células não divisivas, como neurônios pós-mitóticos.
- O sistema de vetor Paciz é recomendado para expressão eficiente de proteínas recombinantes.
Propósito do Estudo
- Demonstrar o processo de expressão e purificação de proteínas em E. coli.
- Ilustrar a aplicação de proteínas de fusão permanente em cultura celular.
- Explorar o uso de recombinação específica de sítio para modificação genética de células-tronco.
Métodos Utilizados
- Inoculación de culturas noturnas de bactérias transformadas.
- Uso de meio LB e meio TB para expressão de proteínas.
- Indução da expressão de proteínas usando IPTG.
- Purificação de proteínas usando cromatografia de afinidade de níquel.
Principais Resultados
- Expressão bem-sucedida de proteínas recombinantes em E. coli.
- Purificação eficiente de proteínas de fusão marcadas com histidina.
- Demonstração da transdução de proteínas em células de mamíferos.
- Insights sobre a influência das tags de fusão nas propriedades das proteínas.
Conclusões
- A transdução de proteínas é uma alternativa viável aos métodos tradicionais de modificação genética.
- O sistema de vetor Paciz facilita a expressão e purificação eficiente de proteínas.
- Pesquisas adicionais são necessárias para otimizar as propriedades das proteínas de fusão para aplicações específicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Protein transduction enables direct delivery of functional proteins into mammalian cells without genetic modification, offering a titratable and reversible approach for target validation in early discovery. This method supports mechanistic de-risking by allowing rapid interrogation of protein function in disease-relevant systems, including non-dividing cells such as neurons. It provides a scalable platform for assay development and phenotypic screening where genetic tools are limited or undesirable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of target proteins through direct delivery, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Provides a titratable system to modulate protein activity in a controlled, dose-dependent manner.
- Predictive Value: Reduces reliance on overexpression artifacts, improving confidence in target engagement and phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable outputs such as recombination efficiency, enabling robust assay readouts for compound or modulator screening.
- Operational Value: Utilizes standardized purification via histidine tag and nickel affinity chromatography, ensuring reproducibility across batches.
- Scalability: Supports large-scale expression in E. coli using TB media and IPTG induction, facilitating consistent reagent supply for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers active Cre recombinase to validate loxP-based reporter systems, enabling preclinical assessment of genetic modification efficiency.
- Disease-Relevant System: Effective in post-mitotic neurons and primary cells, supporting target validation in neurologically relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows temporal control of protein activity to distinguish on-target effects from compensatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a chemically inducible, non-genetic tool for target validation, bridging recombinant protein production with functional cellular assays in a scalable format.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein function through direct delivery and intracellular activity measurement.
- Screening: Enables standardized, reproducible protein preparation for high-confidence screening of modulators or genetic backgrounds.
- Analytics: Generates quantitative functional readouts (e.g., recombination efficiency via blue-white screening) to compare conditions and guide decision-making.
- Translational Research: Connects in vitro recombination efficiency to preclinical genetic modification outcomes in stem cell models.
- Enterprise Reuse: The Paciz vector system and purification protocol establish a reusable platform for producing diverse cell-permeable proteins across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by avoiding genomic integration and enabling acute, reversible protein modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, purified recombinant protein with consistent activity, reducing variability in functional assays.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision accuracy by providing direct functional evidence of target engagement in complex cellular environments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant, non-dividing cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, purification, and mammalian cell culture for transduction assays.
- Dependent on nickel-affinity chromatography infrastructure and access to IPTG, TB media, and protease inhibitors for lysis.
- Necessitates standardization of transduction conditions (e.g., protein concentration, incubation time) across cell types due to serum sensitivity and variable uptake efficiency.
- Requires optimization of fusion tag arrangement (e.g., TAT, NLS, His-tag) to balance solubility, yield, and biological activity.
- Limited by the need to empirically determine active concentration and incubation duration for each target protein and cell type.
