Name: Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: Aprenda a expressar e purificar proteínas recombinantes em E. coli usando cromatografia de afinidade com níquel. Este método de transdução proteica permite a entrega direta de proteínas em células mamíferas sem modificação genética permanente.

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Agradecemos a Oliver Brüstle e todos os membros do Grupo de Engenharia de Células-Tronco da Universidade de Bonn, de apoio e valiosas discussões. Agradecemos a Sabine Schenk para a preparação do SDS-PAGE e apoio permanente ao longo do projeto. Nicole Russ e Anna Magerhans prestou apoio técnico excelente. Além disso, gostaríamos de agradecer a Andreas Bär e Sheila Mertens para a produção do filme. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Volkswagen (Az I/77864) eo Ministério Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF, 01 GN 0813).

Construção de vetor de expressão e de expressão: O vetor de expressão pSESAME-Cre foi construído através da inserção de um fragmento de Cre-codificação em pSESAME através de sites e AvrII NheI restrição utilizando os métodos de clonagem padrão. pSESAME codifica uma proteína de fusão que consiste de uma tag histidina, TAT-domínio, a seqüência NLS e Cre, abreviado HTNCre. À manifestação de HTNCre o pSESAME-Cre foi transformado em TUNER (DE3) pLacI e usado para preparar um estoque de glicerol. <ol><li> Uma cultura de over-noite, foi inoculado com uma ponta de pipeta revestidos com bactérias transformadas a partir do estoque de glicerol. A cultura noite mais consistia em media LB suplementado com glicose 0,5% [v / v] e carbenicilina numa concentração final de 50 mcg / mL e foi autorizado a crescer a 37 ° C por 16 horas. </li><li> Dia seguinte, a densamente cresceu durante a noite de cultura foi usada para inocular a cultura de expressão na proporção de 1 a 40 e foi colocado em uma incubadora a 37 ° C. Cultura consistia expressão dos meios de comunicação TB suplementado com glicose 0,5% [v / v] e ampicilina na concentração final de 100 mcg / mL. </li><li> Em um OD 595 de 1,5 a cultura expressão foi induzida com IPTG 0,5 mM por 1 h. </li><li> Posteriormente as bactérias foram coletadas por centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos em um rotor SLA3000. </li><li> Pellets bactérias foram armazenadas a -20 ° C até a purificação. </li></ol> Purificação de proteínas de células-permeável: <ol><li> Pellets congelados bactérias foram ressuspendidas em 10 mL tampão de lise por cultura frasco litro por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Suspensão foi, então, incubadas com lisozima 1 mg / mL para o adicional de 15 minutos, enquanto a mistura em temperatura ambiente. </li><li> 25 U / mL benzonase foi adicionado depois e incubados durante a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Depois de sonorização no gelo por 1,5 min com 0,5 pulsos s em 45% do poder, 1 mL de buffer sal fria tartárico (TSB) por mL de suspensão foi cuidadosamente adicionado durante a mistura e incubado por 5 min no gelo. SDS-PAGE da amostra da fração lisado (L) foi tirada. </li><li> Lisado limpo foi obtida por centrifugação a 4 ° C por 30 min a 30.000 g. SDS-PAGE de amostras das frações solúvel (S) e insolúvel (I) foram tomadas. </li><li> O sobrenadante foi transferido para novos tubos de 50 mL falcon e foi então delicadamente misturados por 1 hora a 4 ° C com 2 mL de 50% Ni-NTA suspensão por litro de cultura expressão inicial. </li><li> A suspensão foi embalado em um fluxo de gravidade coluna EconoPac (SDS-PAGE amostra de fluxo através fração (FT) foi tomada) e lavadas duas vezes com 5 leitos volumes de tampão de lavagem. SDS-PAGE de amostras de ambas as frações de lavagem (W1 e W2) foram coletados. </li><li> HTNCre contendo frações foram eluídas com três cama-volumes de tampão de eluição e amostra da fração eluato (E) para análise de SDS-PAGE foi tirada. </li><li> Imidazol foi removido por diálise contra tampão de eluição fração elevada de sal duas vezes. </li><li> A solução de proteína foi ainda mais concentrada por diálise contra tampão glicerol duas vezes. Em todas as etapas de diálise a relação de tampão para amostra foi de pelo menos 50. Este procedimento resultou em uma solução estoque contendo glicerol HTNCre na concentração usual entre 200 e 450 mM, ou seja, 1 litro de cultura expressão resultará em ~ 12 mg de proteína. Amostra de estoque de glicerol (GS) para SDS-PAGE análise foi coletado. HTNCre solução estoque pode ser armazenado a menos 20 ° C. </li></ol><img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: SDS-PAGE análise das amostras coletadas durante o processo de purificação da Cre recombinase. Indução da expressão do Cre é indicado por banda dominante na fração de lisado. Embora uma parte da proteína é insolúvel da proteína Cre pode ser enriquecido como visto no eluato e frações de ações glicerol. L: Lysate, I: Insolúvel, S: O sobrenadante, FT: Flow-through, W: E lavar roupa,: eluato, GS: Stock Gylcerol. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. Transdução de proteína em camundongos-tronco embrionárias (ES) células: <ol><li> Células ES carregando uma condicional β-Galactosidase repórter construir cinco foram semeadas como células isoladas usando TrypLE ™ Express para a dissociação de células aderentes. Após 4 a 6 horas as células tinham re-inscritos e meio foi removido. </li><li> Posteriormente as células ES foram incubadas com HTNCre meio contendo por 16 horas. <ul><li> Uma quantidade adequada de proteína HTNCre (correspondente a 10 mM) do estoque de glicerol foi diluído em meio ES e posteriormente filtrado estéril (0,22 m). </li></ul></li><li> Depois de meio de transdução de proteína foi alterado novamente para meio de crescimento normal. </li><li> Depois de dois dias as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído 4% (PFA) por 10 minutos. </li><li> Dois aditradicionais etapas de lavagem com PBS foram executados antes de X-Gal coloração foi realizada. </li><li> Células fixadas foram cobertos com uma camada de X-Gal solução de coloração 6 e incubadas durante a noite a 37 ° C. </li></ol> Resultados representativos: No dia seguinte solução de coloração X-Gal foi aspirado e as células foram cobertos com uma camada de PBS para a análise de microscopia. 8-10% das células recombinadas pôde ser observado no interior das células ES de camundongos julgado por β-Galactosidase atividade.

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li>
<li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl%2FTal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li>
</ol>

Durante o processo de purificação da proteína de fusão Cre, é importante não omitir a adição de gelo tampão TBS frio antes da centrifugação. Caso contrário Cre recombinase tende a precipitar dentro do buffer de glicerol. Se a fração eluato parece tornar-se turva devido à alta concentração de proteína de fusão do buffer de eluição deve ser adicionado até que a solução cancelou novamente. A aplicação de 10 mM de Cre proteína de fusão normalmente resulta em uma eficiência de recombinação de 80 a 100%. Soro fetal bovino (FCS), sendo um componente importante do ES médio de células inibe fortemente transdução de proteína. Portanto, alta concentração de Cre recombinase teve que ser usado. Ao trabalhar no soro livre de condições menos proteínas (0,5-2 mM) pode ser utilizado para alcançar a eficiência de recombinação semelhante. Com o sistema vector pSESAME na mão pode-se aplicar a técnica de transdução de proteína para outras proteínas, incluindo fatores de transcrição como Oct4 e Sox2 7 e 8 Scl/Tal1.

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>Triptona/Peptona</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-tártaro, sal dissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calda de Ni-NTA a 50%</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>Colunas EconoPac</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Filtro estéril 0,22&amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio LB</td><td></td><td></td><td>Extrato de levedura, Triptona/Peptona, NaCl</td></tr><tr><td>Meio TB</td><td></td><td></td><td>Extrato de levedura, Triptona/Peptona, Glicerol, K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tampão de Lise</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 mM Tris, pH 7,8</td></tr><tr><td>Tampão de Sal de Tártaro (TSB)</td><td></td><td></td><td>PTB contendo 2 M de ácido L-tártaro, sal dissódico, e 20 mM de imidazol</td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol</td></tr><tr><td>Tampão de Eluição</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol</td></tr><tr><td>Tampão de Alta Salinidade</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>Tampão de Glicerol</td><td></td><td></td><td>50% glicerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Express</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro de Feto Bovino (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração com X-Gal:</td><td></td><td></td><td>4 mM K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;), 4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;),&lt;br/&gt;2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0,4 mg/mL X-Gal dissolvido em PBS</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de proteínas cell-permeáveis

Engineering Cell-permeable Protein

A técnica de transdução de proteína permite a entrega directa do material biologicamente ativo em células de mamíferos [para revisão ver 1,2]. Para este pode-se fazer uso da capacidade translocação dos peptídeos chamada célula penetrante (CPPs), também designado como domínios de proteína de transdução (PTDs). O TAT-CPP derivado do tipo de vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) Tat proteína (trans-ativador de transcrição) tem sido amplamente utilizada. O TAT positivamente carregada promove permeabilidade celular, assim, superar as barreiras da membrana celular por endocitose e / ou penetração direta da membrana 2. Em combinação com um sinal de localização nuclear (NLS) proteínas de fusão são capazes de entrar a funcionalidade núcleo expositoras. Nossa apresentação em vídeo demonstra, como uma exemplificação para a engenharia de células-permeável proteínas, a construção, produção e aplicação de uma versão de células-permeável do DNA-enzima Cre modificando. Cre recombinase é um site-specific que é capaz de reconhecer e recombinar base de 34 sites de loxP par em células de mamíferos in vitro e in vivo. Portanto, o sistema Cre / loxP é amplamente utilizado para condicionalmente induzir mutações no genoma das células vivas 3,4. A entrega de ativos Cre recombinase para as células, no entanto, representa uma limitação. Nós descrevemos o sistema vector pSESAME, que permite uma inserção direta do gene de interesse e fornece uma plataforma para rapidamente clone diferentes domínios e marcas usadas dentro do vetor de uma maneira conveniente e padronizado. Reorganização das tags diferentes tem sido mostrado para modificar as propriedades bioquímicas das proteínas de fusão com a possibilidade da obtenção de maior rendimento e melhor solubilidade. Demonstramos como expressar e purificar recombinante de células-permeante proteínas e de E. coli. A funcionalidade da proteína recombinante Cre está finalmente validada em cultura de células, avaliando sua atividade recombinase intracelular.

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

A técnica de transdução de proteínas permite a entrega direta de material biologicamente ativo em células de mamíferos [para revisão, veja 1,2]. Para isso, pode-se...

A manipulação da função celular pode ser alcançada por meio das abordagens clássicas de transfeção de DNA ou transdução viral nos últimos 15 anos. Outro método se desenvolveu. A proteína biologicamente ativa pode ser diretamente entregue em células de mamíferos utilizando pequenos peptídeos fundidos à proteína de interesse, o que promove a captação celular.Como nenhum DNA é utilizado, o risco de agênese por esforço é evitado. Em contraste com os métodos clássicos mencionados acima, a transdução proteica permite a entrega de proteínas de maneira titulável.Além disso, pequenas populações celulares, bem como células não divididas, como neurônios pós-mitóticos, podem ser moduladas. Para expressar proteínas recombinantes de maneira eficiente, recomendamos o uso do sistema de vetor Paciz. Trata-se de um sistema modular de vetores composto por uma variante terminal N e uma variante terminal C.Os dois vetores permitem a inserção fácil do seu gene de interesse para fins de purificação. Uma marcação de histidina é integrada, bem como um domínio de transdução proteica. No nosso caso, o toque do vírus HI promove a captação celular para distribuição intracelular.Um sinal de localização nuclear completa o vetor por razões de controle, e as marcas de fusão podem ser simplesmente removidas. Além disso, a disposição dessas marcas pode ter grande influência sobre as propriedades das proteínas de fusão. A influência sobre o rendimento e a pureza, bem como sobre a comercialização e a função biológica, não é previsível.Olá, meu nome é Bernard Mus e trabalho no grupo de Engenharia de Células-Tronco do Instituto de Neurobiologia Reconstitutiva em Bonn, Alemanha. Olá, meu nome é Christoph P e também sou membro do Laboratório Hoover. Nosso grupo utiliza intensivamente a técnica de transdução proteica para entregar diretamente proteínas biologicamente ativas em diversas células de mamíferos, e hoje vamos orientá-lo pelo processo de expressão e purificação em e a partir de e coli.Posteriormente, gostaríamos de mostrar como aplicar a proteína de fusão celular permanente em cultura celular para exemplificar todo o procedimento de expressão, purificação e aplicação. Utilizamos a recombinase Cre específica de sítio para modificar geneticamente células-tronco embrionárias de camundongo. Ok. Ok. Vamos começar.Para inocular a cultura de crescimento noturno, utilizamos bactérias previamente transformadas armazenadas em estoque de glicerol a menos 80 graus centígrados. Essas bactérias já contêm o vetor que codifica a recombinação decre. Usando uma ponteira de pipeta, raspamos uma pequena quantidade das bactérias na ponteira e a adicionamos ao béquer contendo a cultura de crescimento noturno.A cultura de crescimento noturno consiste em meio LB suplementado com glicose numa concentração final de 0,5% e 50 microgramas de insulina carbônica por ml. Em seguida, o béquer é colocado em um incubador a 37 graus centígrados para a expressão do Recombinate Cree específico ao sítio. Estamos utilizando meio TB pré-aquecido para a cultura de expressão em larga escala.Para acelerar a expressão, recomendamos o uso de meio TB aquecido a 37 graus centígrados, que representa a temperatura durante a expressão da proteína recombinante. Em seguida, adicionamos glicose ao meio TB numa concentração final de 0,5%. A glicose impede um aumento na expressão basal da proteína de fusão durante o crescimento da cultura de expressão antes da indução. Por fim, a ampicilina é adicionada à cultura de expressão numa concentração final de 100 microgramas por ml para assegurar uma cultura pura contendo apenas as bactérias que ainda possuem o plasmídeo que codifica a proteína decree.Agora podemos obter nossa cultura de crescimento noturno e inocular a cultura de expressão na proporção de um para 50. Os béqueres são então transferidos para um incubador operando à temperatura de 37 centígrados. Você deve coletar amostras para medir a densidade óptica em intervalos regulares durante toda a expressão.Assim que o cultivo atingir uma densidade óptica de 1,5, as bactérias são induzidas com uma concentração final de 0,5 milimolar de IPTG. Após uma hora de indução, o cultivo de expressão é transferido para tubos e posteriormente colhido por centrifugação. Para esse fim, estamos utilizando um rotor SLA 3000.A centrífuga está funcionando a uma velocidade de 5.000 rotações por minuto durante 10 minutos a quatro graus Celsius. O sobrenadante então é descartado e o pellet bacteriano pode ser armazenado indefinidamente a menos 20 graus centígrados. Os pellets congelados são ressuspendidos em tampão lizza, um volume equivalente a um litro de cultura de expressão.Utilizamos 10 mL de tampão lizza e aguardamos aproximadamente 15 minutos até a solução ficar homogênea. Em seguida, adiciona-se um miligrama de lisozima por cada mL de suspensão. A solução é misturada durante 20 minutos para permitir que a enzima rompa as bactérias.Posteriormente, é adicionado Benson Nase em uma diluição de um para 1000 por mais 15 minutos, o que cortará o DNA, resultando em uma solução não viscosa. Finalmente, um sonador é usado para garantir a lise das células. O programa é executado por um minuto e meio com uma potência de 45% após a conclusão da certificação.Lembre-se de coletar uma amostra de cada etapa aqui, o lisado bruto ou a análise em gel SDS-PAGE da purificação. Agora é realmente importante adicionar um mL de tampão TSB gelado por mL de suspensão, pois a proteína decree tenderá a precipitar no estoque de glicerol. Se você for pular esta etapa, misture a solução brevemente e o material bruto estará pronto para centrifugação.Para esse fim, utilizamos um rotor SS 34. A centrífuga opera a 17.000 RPM durante 30 minutos a quatro graus centígrados. Ao finalizar, o sobrenadante S é cuidadosamente transferido para tubos Falcon frescos de 50 ml.Agora, adicione a suspensão de níquel anti A ao sobrenadante contendo níquel. O anti A é um reagente essencial para a purificação adequada das proteínas de fusão com marcação de histidina. A histidina forma um complexo com os íons de níquel, permitindo a purificação por afinidade; agora, agite suavemente os tubos em repouso por 60 minutos a 40 graus Celsius.Após uma hora, você já pode aplicar a suspensão em colunas de 20 mL e deixar a solução passar por fluxo gravitacional. Para produções em larga escala, é viável dividir a suspensão em várias colunas. Em seguida, lavamos a coluna duas vezes com um tampão contendo 15 milimolares de innersole.A quantidade de tampão aplicada depende do volume da resina. Dois MLS de níquel NTA correspondem a um ml de resina para fins de lavagem. Adicionamos cinco volumes da resina de tampão de lavagem na coluna; após a lavagem, estamos agora prontos para eluir nossa proteína.Portanto, utilizamos um tampão de eluição com uma concentração de 250 milimolar de imimo. Observe como a cor da resina muda para o verde. Devido às altas concentrações da proteína CRE, a fração OID às vezes fica escura.Para evitar isso, misture a solução e adicione tampão de lise adicional; todas as frações agora são reunidas e subsequentemente transferidas para um tubo de diálise. A lise removerá o ole. O primeiro passo de diálise é realizado contra o tampão contendo uma alta concentração de sal. Após uma hora, o tampão com alto teor de sal é substituído e o procedimento de diálise é aplicado durante a noite.No dia seguinte, o tubo de diálise é retirado do tampão com alto teor salino e transferido para um tampão de glicerol. Após três a cinco horas, o tampão de glicerol é substituído e a diálise é novamente realizada durante a noite. A lise em tampão de glicerol resultará em uma solução estoque concentrada em pelo menos três vezes.A solução estoque pode agora ser armazenada a menos 20 graus centígrados por vários anos sem perda de atividade. Para garantir a qualidade, você pode carregar as amostras coletadas de SDS-PAGE em um gel e posteriormente corá-lo. Para Kamasi, a proteína de fusão Cree é detectável como uma faixa proeminente na fração OID. Para utilizar a concentração apropriada de recombinação Crew, você deve determinar a concentração por meio do ensaio de Redford.Como aplicar proteínas permanentes em células de mamíferos. Primeiramente, prepare suas células-alvo para alcançar as maiores eficiências de transdução proteica. Observe células em monocamada na densidade que resultará em uma camada celular com 80 a 90% de confluência no dia seguinte, caso suas células-alvo sejam células yes, cultivadas em colônias compactas.Se pare as células somáticas e observe-as em suspensão simples de células com cinco horas de antecedência. É importante obter uma suspensão simples de células antes da transdução proteica, pois, caso contrário, apenas as células aéreas na superfície de uma colônia poderão ser transfundidas. Aspire o meio e lave brevemente as células aéreas com PPS antes do tratamento.Remova o meio grosso restante contendo soro. Após aspirar as células com a sobreposição de PPS gota a gota, deixe-as incubarem por três a cinco minutos. Agora, verifique ao microscópio se todas as colônias se dissolveram em células isoladas.Devido às razões mencionadas anteriormente, esta é uma etapa crucial para a transdução proteica em células yes. Transfira as células destacadas para um tubo. Coloque o tubo em uma centrífuga e centrifugue para sedimentar as células. Aspire o sobrenadante e re-suspenda a célula.P no meio de crescimento dilua as células para o número apropriado. Isso, é claro, depende do tamanho da cultura de tecidos. Incube as células em placa por mais cinco horas.Isso dará às células aéreas tempo suficiente para se fixarem no fundo e crescerem aderentes. O estoque de três linhagens pode ser armazenado a menos 20 graus por mais de dois anos. Ao trabalhar com proteína de fusão permanente recombinante, é muito benéfico ter uma solução estoque como essa, que pode ser usada sob demanda.Enquanto espera as células aderirem à placa, pode-se preparar o meio de transdução C diluindo simplesmente um volume apropriado de proteína de expressão celular permanente a partir do estoque de colesterol no meio. Como a solução estoque de Clare ainda não é estéril, o meio de transdução precisa ser filtrado esterilmente antes de sua aplicação. Recomendamos o uso de uma seringa que possa ser rosqueada em um filtro de ligação de proteína de lobo.A concentração final de creek depende do tipo celular ou dos suplementos do meio. Por exemplo, o soro exerce uma forte influência negativa na eficiência de transdução. Isso pode ser superado utilizando meio livre de soro ou aumentando a concentração de creek.Encontramos a condição ideal que permite a maior eficiência de recombinação. Hidrate a concentração do decreto a partir de 0,5 até 10 micromolares. Recomendamos testar diferentes tempos de incubação entre seis e 18 horas.Após cinco horas de incubação, retire suas células-alvo e aspire o meio cruzado. Posteriormente, substitua-o por meio de transdução proteica e coloque as células de volta no incubador após incubação noturna. Lave brevemente as células D com PPS e substitua o meio de transdução proteica por meio ES normal.48 horas após a incubação, a expressão gênica permanente da célula Cree pode ser detectada por meio de xul. As células coradas com fenótipo positivo para bega foram geneticamente modificadas com sucesso por meio da recombinação específica de sítio. Cree o relatório.As células que abrigam a construção CRE-Lae mediante recombinação pré-mediana têm uma sequência de parada flanqueada por P removida, e um gene repórter luxe é ativado sob o controle do promotor team. Para avaliar a eficiência de recombinação em células aéreas repórter pré-tratadas, as células devem ser fixadas.Aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS, recubra as células com PFA 4% e incube-as por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células mais uma vez três vezes com PBS. Após aspirar o PBS do último passo de lavagem, adicione a solução de coloração Xal aos poços e incube as células durante a noite a 37 graus em um incubador.No dia seguinte, a atividade Beal pode ser monitorada por meio de células com halo azul. A eficiência de recombinação pode ser determinada pelo número de colônias azuis. Em condições ideais, você deverá ser capaz de alcançar uma eficiência de recombinação superior a 90%. Muito bem, hoje mostramos a vocês como expressar e purificar a recombinação específica de sítio a partir de E. coli.Neste estudo de prova de princípio, foi possível induzir recombinação na maioria dos sais. Ok, é isso. Boa sorte com seus Experimentos.I.

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Biologia

Este vídeo discute o ensaio de vazamento de fluorescência para estudar as interações de peptídeos que penetram nas células com as membranas celulares usando imitadores de membrana celular - grandes vesículas unilamelares, ou LUVs, encapsuladas com um corante fluorescente e um atenuador.

Ensaio de vazamento de fluorescência para estudar a interação do peptídeo que penetra nas células com a membrana

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a orientação e topologia de proteínas integrais de membrana em células vivas. Este protocolo simples baseia-se na sensibilidade seletiva da protease das quimeras entre a proteína de interesse e a GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) combina entrega consistente e de alto rendimento com alta viabilidade celular. A introdução de medições de impedância elétrica transepitelial (TEEI) fornece informações sobre os processos intermediários do PSEP e permite a entrega sem rótulos. Este artigo discute um método para realizar experimentos de entrega de PSEP e análise de medição TEEI simultaneamente.

Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

Aprenda a expressar e purificar proteínas recombinantes em E. coli usando cromatografia de afinidade com níquel. Este método de transdução proteica permite a entrega direta de proteínas em células mamíferas sem modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

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