Name: Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a otimizar a cristalização bidimensional de proteínas de membrana para cristalografia eletrônica. Este método utiliza microscopia criogênica e processamento computacional de imagens para determinar estruturas de alta resolução.

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Agradecemos aos nossos colaboradores para fornecer amostras de proteínas valiosas, que contribuíram para algumas das nossas experiências e observações métodos relacionados. Günther Schmalzing gentilmente cedido a oportunidade de FR para participar deste projeto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills são agradecidos por sua ajuda em circulação e de entrada no equipamento. O financiamento foi fornecido pelo NIH conceder HL090630.

1. Preparação grade de Ensaios Cristalização 2D <ol><li> Carbono revestido de 400 malha de cobre EM grades são preparados por mancha negativa. Acetato de uranila é freqüentemente usado e fornece uma mancha de longa duração em termos de armazenamento da solução por vários meses antes do uso, bem como aptidão para armazenamento de longo prazo das grades. Em contraste, outras manchas negativas, como formiato de uranila, proporcionando excelente coloração, precisam ser feitos recentemente 1. Para a preparação rápida de um grande número de redes a ser utilizado para triagem de ensaios de cristalização em 2D, uma versão modificada da coloração negativa é usado. Um volume de 2 mL de amostra pipetado está dentro de uma grade de carbono coberto de EM e incubados por 60 s. Isso é seguido por blotting da borda com um pedaço de Whatman # 4 papel de filtro (Figura 1; de vídeo), e em seguida, 2 mL de acetato de uranila 1% são aplicadas imediatamente, que são apagados novamente a partir da borda da grelha depois de 30 s. Tocar a rede na borda com a borda rasgada do papel de filtro garante a remoção ideal de líquido sem remoção de proteoliposomes. Além disso, a secagem na borda da rede garante melhor preservação do filme de carbono. Cuidados devem ser tomados no preparo e manuseio das grades, como a quebra do filme de carbono previne a adesão da amostra delicada e pode resultar em uma representação imprecisa da amostra. Enquanto os volumes de amostra, tradicionalmente maiores de 5 mL foram e são usados ​​rotineiramente para a preparação de grade, amostras preciosas podem ser salvas através da redução do volume para 2 mL ou menos 2. </li><li> Para produzir o maior membranas possível, algumas de nossas amostras requerem altas concentrações de glicerol ou sacarose (10-20%) para estar presente no buffer de diálise. Isso pode ter um efeito negativo sobre a preparação da rede, como o glicerol ou sacarose é altamente viscosa e impede acetato de uranila de penetrar adequadamente o buffer e, portanto, incompleta coloração das membranas. Consequentemente, uma grade possível será obscurecida. Ou o buffer pode ser trocado por centrifugação das amostras e substituição por glicerol / sacarose livre de buffer (não mostrado), ou as grelhas podem ser lavadas com tampão ou glicerol / sacarose livre de buffer em um a vários ciclos antes coloração negativa semelhante ao uma técnica usada para crio-EM 3,4. </li></ol> 2. Avaliar Trials Cristalização 2D por EM <ol><li> Dependendo do tipo de porta-amostras, ou uma ou várias redes são carregados. A ampliação de dois-10K, que será referido aqui como ampliação de intermediários, permite uma primeira impressão de distribuição de média e grau de dispersão das membranas, morfologia e tamanho, que é tomado conhecimento no caderno de laboratório 5. Áreas adequadas são registrados como representante súmulas com a ajuda de uma câmera CCD ou, se uma câmera CCD não está disponível, no filme. </li><li> Baixa ampliação na faixa de cerca de 400-800x é usado nos momentos em que uma visão geral de toda a amostra / grid é desejada. Embora não seja empregada em cada grade, baixa ampliação fornece informações valiosas de ajuda na avaliação da preparação da rede em termos de vários aspectos: ambos coloração negativa e quebra parcial potencial do filme de carbono, a concentração da amostra na grade, e possivelmente irregular distribuição proteoliposome. Quadrículas indivíduo pode ser visto com binóculos ou a câmera CCD. Com alguns EMs é possível salvar posições de interesse particular, que pode ser recuperado para inspeção posterior em ampliações maiores. </li><li> Uma vez que uma área da grade de interesse foi identificada em uma ou outra ampliação baixa ou intermediária, a ampliação é alterado para cerca de 60K 50K. Dependendo do cristal de membrana, eo tamanho da célula unitária, se conhecido, ampliações tão baixo quanto 30K e tão alta como 80K são usados. A gama de ampliação de 30-80K será referido como alta ampliação para fins de triagem para cristais 2D. Focando ocorre tanto na definição do foco da baixa dose set-up, com a opção após a imagem / foto configuração, ou nas imediações da área de interesse. <ol class="lalpha"><li> Em caso de ambiguidade em saber se a área de interesse é de fato uma membrana, a amostra é inspecionado para o carbono-filme do tamanho do proteoliposomes, mica, ou outros artefatos. Para esta finalidade, dobrando as bordas revelar e morfologia típicas. </li><li> Agora, a área de interesse é inspecionado com uma câmera CCD. Uma imagem CCD é coletado na 30K-80K ampliação, dependendo do tamanho da membrana, as proteínas ou o tamanho da célula unitária, ou conhecida área cristalina. A rede de uma proteína de membrana menores e / ou na maior parte hidrofóbica não é necessariamente visível pela avaliação visual da imagem CCD-se. Nem toda a imagem é usada para transformar um online-Fourier (FT, ou rápido FT-FFT). Este FT irá conter uma quantidade significativa de ruído, no entanto, se o conjunto ordenado é pequeno. Assim, um tamanho da imagem reduzida em caixa permitirá uma relação sinal-ruído melhorada de um smalLer cristal e uma identificação mais fácil. Para este fim, a caixa é movido sobre a imagem e um FT viver é avaliada. A intensidade / brilho do feixe é ajustado mantendo baixa dose condições para a amostra, bem como as configurações da câmera CCD em mente. Dependendo da câmera CCD utilizado, a gama da FT ao vivo é ajustado para a identificação ideal de conjuntos ordenados. Um valor muito elevado podem obscurecer pontos devido às contribuições de ruído, e um valor de gama excessivamente baixos irá impedir pontos mais fracos de ser identificados. Estes pontos mais fracos pode ser devido à menor matrizes cristalinas com manchas na FT pouco acima do nível de ruído. Embora os dados com maior resolução tiver sido coletado de um pequeno número de amostras 6, comumente a resolução de cristais negativamente coradas em 2D é limitada ou não se deve esperar para ser melhor do que a resolução aproximadamente 15A. Com um defocus de aproximadamente -400 nm, e não mais de 1-3 ordens de manchas devem ser facilmente identificados. Amostras geralmente não são avaliados para a resolução, como crio-EM coleta de dados dará uma indicação adequada de resolução mais alta possível. Nitidez de manchas e mosaicity possíveis são anotados embora. </li></ol></li><li> Membranas diferentes, assim como morfologias membrana, são avaliados para a ordem em grandes ampliações. Isto é particularmente crítico no início ou estágios intermediários de ensaios de cristalização em 2D, como proteoliposomes menores ao invés de maior ou remendos da membrana pode conter as áreas mais promissoras. Percentagens muito baixas de cristais 2D vai exigir a aquisição de imagens e FT, ou de difração óptica, de um grande número de imagens desde a identificação inicial de conjuntos ordenados, com freqüência levam a rápida melhoria do tamanho e qualidade 2,4,7. </li></ol> 3. Resultados representante Proteoliposomes idealmente ordenou mostrar facilmente reconhecíveis, pontos afiados. Cristais grandes e bem ordenadas são facilmente identificados por online-FT de imagens CCD ou de difração óptica de micrografias. O exemplo mostra cristais 2D de uma proteína de membrana de 18kDa pequenos que são até vários microns de tamanho. Manchas na FT são facilmente identificados e afiada. O movimento da caixa de live-FT mostra que a malha é contínua, sem mosaicity. A rede de uma grande proteína com um domínio mais extenso solúveis pode ser identificado na tela pequena do EM. CCD coleção de imagens e FT é necessário fornecer um meio de melhor avaliação e para obter informações sobre, mosaicity, por exemplo, possível (show FT). Ao calcular uma FT de um proteoliposome que não é imposta, o ruído pode ser inicialmente confundido com spots. Enquanto a caixa para o live-FT é movido, no entanto, as manchas desaparecerão. Por outro lado, as matrizes de pequeno porte, com cristalinidade questionável, terão suas vagas restantes estacionária quando o live-FT é movido até um pouco mais a área da imagem. Além disso, estes pequenos cristais podem ser reconhecidos por geralmente ter os tamanhos mesma célula da unidade, e as distâncias entre pontos diferentes no SFT pode ser medido de várias maneiras, como com um círculo de um tamanho específico. Cristais de lipídios exibir uma morfologia distinta e lattice FT. Não é incomum encontrar precipitação em ensaios iniciais. Aqui precipitação de proteínas, sem a reconstituição precisa ser distinguido de agregados lipídicos pequenos embora. Amostras que parecem ser precipitados em baixa ampliação freqüentemente acabam por ser agregados de lipídios, quando visto em maior ampliação. Após a inspeção de 30-50K, as bordas dessas estruturas escuras revelam que eles são compostos de membranas, sem precipitação da proteína. Estas são observações importantes como os agregados de lipídios pode ser aumentado de tamanho grande para as membranas nos experimentos seguintes. Maus resultados em amostras de avaliação são, por vezes ligado a uma concentração baixa de membrana que impede a triagem adequada e rápida. Isto pode frequentemente ser superado com o uso de uma maior concentração de proteína para a cristalização 2D por diálise. Alternativamente, as membranas podem ser deixados de se contentar com alguns dias na parte inferior do tubo Eppendorf durante o armazenamento. Em alguns casos, a resolução rápida, ou quase instantânea de membranas ocorre e pipetagem da parte inferior do tubo irá resultar em uma maior densidade de membrana no grid. Outra opção é muito mais rápida centrifugação (em 3000-8000 rpm durante 1-3 minutos) das amostras com amostragem posterior da parte inferior do tubo. Amostras em condições ideais irá conter uma grande percentagem de cristais 2D. Não é necessário apontar para uma aparência homogênea das membranas, como a coleção maior e mais bem ordenada cristais 2D são selecionados visualmente para dados. Estes tipos de amostras será facilmente reconhecido quando os ensaios de cristalização são repetidos, bem como quando as amostras são utilizadas paraCryo-EM coleta de dados, resultando em um número máximo de imagens em alta resolução. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esta figura mostra blotting a borda da grade com um pedaço de papel Whatman # 4 filtro.

<ol><li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li>
<li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+membrane+proteins%3A+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li>
<li>Wang, D. N., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a%2Fb-protein+complex+in+three+different+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins%3A+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+%26gamma%3B-glutamyl+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li>
<li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament%3A+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li>
</ol>

Avaliação adequada de amostras requer uma avaliação cuidadosa de um número suficiente de membranas. Por exemplo, amostras com tão baixo como 2% matrizes cristalinas de mais de 180 proteoliposomes imaged deu informações importantes para a otimização rápida de condições de cristalização 2D 7. Quando a precipitação da proteína ocorre, uma grade pode ser abandonado de rastreio mais após a inspeção com pequeno aumento, embora a precipitação parcial ocasional de proteína ocorre. Mesmo m...

<table><tbody><tr><td>Grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre 400-mesh revestida com filme de carbono</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça: comum e anti-capilar</td><td></td><td></td><td>Dumont #5 e Dumont N5AC ou similar</td></tr><tr><td>Micropipeta e ponteiras para pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel filtro Whatman #4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila 1%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amostra de diálise a ser analisada quanto à presença de cristais 2D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de diálise livre de glicerol/sacarose</td><td></td><td></td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão JEOL-1400 (TEM)</td><td></td><td></td><td>TEM similar de 80 &amp;#8211; 120 kV equipado com filamento de Lab6 ou tungstênio e câmeras de filme e/ou CCD (câmeras Gatan Orius SC1000 e/ou UltraScan1000 CCD e pacote de software Gatan Digital Micrograph ou câmeras Tietz (TVIPS))</td></tr></tbody></table>

avaliar trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana pequenas de estudos biologia estrutural por cristalografia electron

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Cristalografia eletrônica tem evoluído como um método que pode ser usado tanto em alternativa ou em combinação com tridimensional cristalização e cristalografia de raios X para estudar estrutura-função perguntas de proteínas da membrana, bem como proteínas solúveis. Triagem para duas dimensões (2D) cristais por microscopia eletrônica de transmissão (EM) é o passo fundamental na busca, otimização e seleção de amostras de alta resolução de coleta de dados por crio-EM. Aqui, descrevemos as etapas fundamentais na identificação de grandes e ordenada, bem como pequenos arrays 2D, que pode potencialmente fornecer informações críticas para a otimização das condições de cristalização. Ao trabalhar com diferentes ampliações no EM, os dados sobre uma série de parâmetros críticos é obtido. Menor ampliação fornece dados valiosos sobre o tamanho e morfologia de membrana. Em ampliações maiores, as dimensões de cristal possível fim e 2D são determinados. Neste contexto, é descrito como câmeras CCD e online-Transformações de Fourier são usados ​​em ampliações maiores para avaliar proteoliposomes para a ordem e tamanho. Apesar de os cristais 2D de proteínas da membrana são mais comumente cultivada por reconstituição por diálise, a técnica de rastreio é igualmente aplicável para cristais produzidos com a ajuda de monocamadas, nativo cristais 2D, e ordenou matrizes de proteínas solúveis. Além disso, os métodos aqui descritos são aplicáveis ​​à triagem para cristais de 2D ainda menor, bem como proteínas de membrana maior, onde as proteínas menores requerem a mesma quantidade de cuidado na identificação como nossos exemplos ea rede de proteínas maiores podem ser mais facilmente identificáveis em fases anteriores do exame.

Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 - 90 kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

A cristalografia eletrônica evoluiu como um método que pode ser utilizado alternativamente ou em combinação com a cristalização tridimensional e o raio X...

O objetivo geral deste procedimento é identificar as condições mais adequadas de cristalização bidimensional para a determinação estrutural de proteínas de membrana por cristalografia eletrônica. Isso é realizado primeiramente utilizando um detergente compatível durante a purificação, a fim de solubilizar a proteína a partir da bicamada lipídica nativa. O segundo passo do procedimento consiste em adicionar lipídio exógeno e remover o detergente por meio de diálise da mistura de proteína, lipídio e detergente, resultando em cristais bidimensionais sob condições cuidadosamente controladas.O terceiro passo do procedimento é congelar rapidamente as amostras em um estado vítreo. O passo final do procedimento é coletar dados por criomicroscopia eletrônica. Em última análise, podem-se obter resultados que revelam a estrutura final da proteína por meio do processamento computacional das imagens dos dados.Olá, sou do laboratório da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Olá, sou Tina Dreaded.Sou do Laboratório Berry da Escola de Química e Bioquímica e do Laboratório Schmidt Kray da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. E eu sou Matt Johnson do laboratório de Ingleborg Schmidt Cry da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Hoje vamos mostrar um procedimento para avaliar ensaios de cristalização em 2D por microscopia eletrônica.Utilizamos este protocolo em nosso laboratório para identificar e otimizar as condições de cristalização em 2D. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, preparam-se amostras com contraste negativo em grades de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre com malha 400 revestidas com carbono. Pipete dois microlitros da amostra de proteolipossoma sob uma grade de TEM recoberta com carbono e incube por 60 segundos.Se a amostra não se distribuir uniformemente, passe suavemente com a lateral da ponteira do pipeto. Em seguida, tamponar a partir da borda com um pedaço rasgado de papel filtro Watman número quatro. Isso garante a remoção ideal do líquido sem remoção excessiva de lipossomos de proteína, ajudando a preservar a delicada película de carbono.Imediatamente após a remoção do líquido. Aplique dois microlitros da solução corante de acetato de uranila a 1% após 30 segundos, removendo o excesso pela borda da grade. Novamente, se a amostra contiver altas concentrações de glicerol ou sacarose viscosos, tipicamente na faixa de 10 a 20%, vários ciclos de lavagem da grade com um tampão livre de glicerol ou sacarose antes da coloração negativa podem ser úteis para permitir uma adequada coloração com a solução de acetato de uranila.Uma vez que as grades tenham sido preparadas, a microscopia eletrônica é utilizada para visualizar a amostra em baixa ampliação, a fim de avaliar a distribuição da ocorrência de membranas, a morfologia e a qualidade geral da grade. Em seguida, utiliza-se alta ampliação para obter imagens e realizar transformadas RIA das imagens, a fim de identificar cristais bidimensionais. Para iniciar, coloque a grade no porta-amostras do microscópio eletrônico e, para obter uma primeira impressão da distribuição média das membranas, utilize uma ampliação intermediária de 2.000 a 10.000 x.Observe a extensão da distribuição das membranas, sua morfologia e tamanho em um caderno de laboratório. Registre vistas representativas com uma câmera CCD. Em seguida, se necessário, observe as amostras com baixa ampliação na faixa de aproximadamente 400 a 800 x para obter uma visão geral das grades.Isso pode fornecer informações valiosas para avaliar a preparação da grade, revelando problemas com a concentração da amostra, distribuição desigual de proteas, lipossomos e rompimento parcial do filme de carbono. Identifique uma área de interesse na grade em baixa ou média magnificação. Em seguida, utilize alta magnificação para avaliar a possível ordem em diferentes membranas.Isso é crítico nas fases iniciais de ensaios de cristalização em 2D. A fim de identificar lipossomos de proteína promissores com áreas bem ordenadas e verificar a reprodutibilidade em experimentos posteriores para determinar a configuração ideal de alta magnificação para triagem de cristais em 2D, comece com uma magnificação entre 50.000 e 60.000 ×. Dependendo das dimensões do cristal em 2D e do tamanho da célula unitária, a configuração de alta magnificação pode ser reduzida até 30.000 ou aumentada até 80.000.Aqui, em uma localização adjacente à área de interesse da imagem, desfocamos em aproximadamente menos 400 nanômetros ou mais, caso haja incerteza quanto à área de interesse ser realmente uma membrana. Inspecione a amostra em busca de fragmentos de filme de carbono, MICA ou outros artefatos que possam ser confundidos com proteolipossomos. Observe também as bordas para identificar dobramentos e morfologia típicos de membranas.Em seguida, inspecione a área de interesse com uma câmera CCD. Ao coletar uma imagem CCD na configuração ótima de alta ampliação, a rede de uma proteína de membrana menor e/ou predominantemente hidrofóbica pode não ser observável pela avaliação visual da própria imagem CCD. Nesse caso, a imagem inteira é utilizada para uma transformada rápida de Fourier online ou ft.No entanto, se a matriz ordenada for pequena, esta TF conterá uma quantidade significativa de ruído; para melhorar a relação sinal-ruído, reduza o tamanho da imagem recortada, mova a caixa reduzida sobre a imagem e realize uma TF em tempo real, ajustando a função gama da TF em tempo real para identificação ideal de matrizes ordenadas. Um valor de gama excessivamente alto pode obscurecer pontos devido a contribuições de ruído, enquanto um valor excessivamente baixo impedirá a identificação de pontos mais fracos. Espere que a resolução dos cristais 2D com contraste negativo seja de aproximadamente 15 angstroms a uma DFO de menos 400 nanômetros.Espera-se identificar de uma a três ordens de pontos. Observe a nitidez dos pontos e qualquer mosaico. Cristais 2D de uma pequena proteína de membrana de 18 quilodaltons têm até várias micras de tamanho.Manchas na TDF nítidas e com movimento facilmente identificável da caixa FT viva indicam que o reticulado é contínuo, sem mosaico. O reticulado de uma proteína maior com um domínio solúvel mais extenso pode ser identificado na pequena tela da coleta de imagens por T-E-M-C-C-D, e as TDFs são necessárias para obter uma avaliação mais precisa da qualidade do reticulado, incluindo características como ruído em mosaico na TDF de uma proteína desordenada. Lipossomos podem ser confundidos com manchas fracas; é necessário determinar se as manchas são devidas a cristais 2D de proteína pequena ou ao ruído.Mova a caixa para o ft em tempo real. Se os pontos desaparecerem imediatamente, são ruído; mas se permanecerem inalterados mesmo em uma pequena área, é provável que haja cristais, já que os cristais lipídicos exibem uma morfologia distinta e ft. Esses cristais lipídicos também podem ser reconhecidos pela inspeção visual de uma imagem e tamanhos consistentes de célula unitária.A precipitação pode ocorrer nos ensaios iniciais. A inspeção em alta ampliação é utilizada para distinguir entre precipitação proteica e agregados lipídicos. No caso de agregados lipídicos, a reconstrução pode ter realmente ocorrido e os próximos experimentos exigirão apenas o ajuste de parâmetros necessários para aumentar o tamanho da membrana e produzir ordem, em vez de induzir a reconstrução em 30.000 a 50.000 x.As bordas dessas estruturas escuras revelam que elas são compostas por membranas sem proteína. Amostras de precipitação em condições ideais conterão uma grande porcentagem de cristais bidimensionais. Não é necessário buscar uma aparência homogênea das membranas, pois os cristais bidimensionais maiores e mais bem ordenados são selecionados visualmente para a coleta de dados.Esses tipos de amostras serão facilmente reconhecidos quando a cristalização dessas amostras for utilizada para coleta de dados de microscopia crioeletrônica, visando obter o número máximo de imagens de alta resolução. Mostraremos apenas como realizar a triagem de cristais 2D de pequenas proteínas de memória por microscopia eletrônica de transmissão ao executar este procedimento. É importante lembrar-se de ser minucioso para não deixar passar uma condição de cristalização promissora, já que você já investiu uma quantidade significativa de tempo e esforço até este momento.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

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Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico que mantêm as proteínas da membrana (MPs) dentro de uma bicamada lipídica, mas têm comportamento de fase única que facilita high-throughput screening por robôs de cristalização. Esta técnica, com sucesso, produziu uma série de alta resolução de estruturas de ambas as fontes procariotas e eucariotas. Este vídeo descreve os protocolos para gerar a mistura bicelle lipídico, incorporando MPs na mistura bicelle, a criação de cristalizações ensaios...

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Aqui é descrito um método para robótica de alto rendimento de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicos para utilização na determinação da estrutura utilizando a cristalografia de raios-X macromolecular. Três robôs capazes de lidar com o viscoso e pegajoso mesofase proteína-laden integrante do método são introduzidos.

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Aqui é descrito procedimentos implementados na membrana Caffrey Estrutural e Grupo Biologia Funcional para colheita e crio-cool cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em fases cúbicas e esponja de uso na determinação estrutura usando cristalografia de macromoléculas de raios-X.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

Este artigo detalha o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ. O processo de microfabização permite integrar uma membrana de diálise regenerada de celulose regenese semipermável com qualquer corte de peso molecular, entre duas camadas do chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

O protocolo apresentado descreve uma abordagem direta para triagem de condições de cristalização de proteínas e crescimento de cristais usando uma placa de diálise de alto rendimento de 96 poços. O uso de tubos dialisadores para o crescimento em larga escala de microcristais também é demonstrado para aplicações de cristalografia seriada e MicroDE.

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Aprenda a otimizar a cristalização bidimensional de proteínas de membrana para cristalografia eletrônica. Este método utiliza microscopia criogênica e processamento computacional de imagens para determinar estruturas de alta resolução.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

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