Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

O objetivo geral deste procedimento é identificar as condições de cristalização 2D mais ideais para a determinação estruturada de proteínas de membrana por cristalografia eletrônica. Isso é feito usando primeiro um detergente compatível durante a purificação para solubilizar a proteína da bicamada lipídica nativa. A segunda etapa do procedimento é adicionar lipídios exógenos e remover o detergente por meio da diálise da mistura de detergente lipídico proteico, resultando em cristais 2D sob condições cuidadosamente controladas.

A terceira etapa do procedimento é piscar e congelar as amostras em um estado vítreo. A etapa final do procedimento é coletar dados por crioem. Em última análise, podem ser obtidos resultados que produzem a estrutura final da proteína por meio do processamento computacional de imagens dos dados.

Olá, sou do laboratório. Eu enterro a Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Oi, eu sou Tina temida.

Eu sou do Berry Lab na escola de Química e Bioquímica e do Schmidt Kray Lab na escola de biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. E eu sou Matt Johnson, do laboratório de Ingleborg Schmidt Cry na escola de biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Hoje mostraremos um procedimento para avaliar os ensaios de coral 2D por em.

Usamos este protocolo em nosso laboratório para identificar e otimizar as condições de cristalização 2D. Então vamos começar Para iniciar este procedimento, amostras coradas negativamente em microscopia eletrônica de transmissão de cobre de 400 mesh revestida de carbono ou grades TEM são preparadas. Pipetar dois microlitros da amostra de lipossomas de protea sob uma grelha MET revestida de carbono e incubar durante 60 segundos.

Se a amostra não se distribuir uniformemente, passe-a suavemente com a lateral da ponta da pipeta. Próximo bloco da borda com um pedaço rasgado de papel de filtro número quatro. Isso garante a remoção ideal de líquido sem remoção excessiva de lipossomas de protea e ajuda a preservar o delicado filme de carbono.

Imediatamente após o borrão. Aplique dois microlitros da mancha de acetato de urinol a 1% após 30 segundos, seque a partir da borda da grade. Novamente, se a amostra contiver altas concentrações de glicerol viscoso ou sacarose, normalmente na faixa de 10 a 20%, vários ciclos de lavagem da grade com um tampão livre de glicerol ou sacarose antes da coloração negativa podem ser úteis para permitir a coloração adequada com a solução de tato urinário.

Uma vez que as grades tenham sido preparadas, a microscopia eletrônica é usada para visualizar a amostra em baixa ampliação para avaliar a distribuição e morfologia da ocorrência da membrana e a qualidade geral da grade. Em seguida, a alta ampliação é usada para obter imagens e realizar transformações RIA das imagens para identificar cristais 2D. Para iniciar a grade baixa no suporte de amostra do microscópio eletrônico, para obter uma primeira impressão da distribuição média da membrana, use uma ampliação intermediária de 2000 a 10.000 x.

Anotar a extensão da distribuição das membranas, sua morfologia e tamanho em um caderno de laboratório. Grave visualizações representativas com uma câmera CCD. Em seguida, se necessário, observe as amostras com baixa ampliação na faixa de aproximadamente 400 a 800 x para obter uma visão geral das grades.

Isso pode fornecer informações valiosas para avaliar a preparação da grade, revelando problemas com concentração de amostra, protea irregular, distribuição de lipossomas e quebra parcial do filme de carbono. Identifique uma área de interesse da grade em ampliação baixa ou intermediária. Em seguida, use alta ampliação para avaliar a ordem possível em diferentes membranas.

Isso é crítico nos estágios iniciais dos testes de cristalização 2D. A fim de identificar lipossomas de protea promissores com áreas bem ordenadas e verificar a reprodutibilidade durante experimentos posteriores para determinar a configuração ideal de alta ampliação para triagem de cristais 2D, comece com uma ampliação entre 50.000 e 60.000 x. Dependendo das dimensões do cristal 2D e do tamanho da célula unitária, a configuração de alta ampliação pode ser reduzida para 30.000 ou aumentada para 80.000.

Aqui em um local adjacente Para a área de interesse da imagem, desfocamos em aproximadamente menos 400 nanômetros ou mais se houver incerteza se a área de interesse é de fato uma membrana. Inspecione a amostra em busca de pedaços de filme de carbono, MICA ou outros artefatos que possam ser confundidos com lipossomas de protea. Observe também as bordas para discernir o dobramento e a morfologia típicos da membrana.

Em seguida, inspecione a área de interesse com uma câmera CCD. Ao coletar uma imagem CCD na configuração ideal de alta ampliação, a rede de uma proteína de membrana menor e/ou principalmente hidrofóbica pode não ser observável pela avaliação visual da própria imagem CCD. Nesse caso, a imagem inteira é usada para uma transformada de foer online ou ft.

No entanto, se a matriz ordenada for pequena, este FT conterá uma quantidade significativa de ruído para melhorar a relação sinal-ruído, reduzir o tamanho da imagem em caixa, mover a caixa reduzida sobre a imagem e executar um ft ao vivo, ajustar a função gama do FT ao vivo para identificação ideal de matrizes ordenadas. Um valor gama excessivamente alto pode obscurecer os pontos devido às contribuições de ruído, enquanto um valor excessivamente baixo impedirá que os pontos mais fracos sejam identificados. Antecipe a resolução dos cristais 2D corados negativamente em aproximadamente 15 angstroms em um DFO de menos 400 nanômetros.

Espere identificar de uma a três ordens de manchas. Observe a nitidez das manchas e de qualquer mosaico. Os cristais 2D de uma pequena proteína de membrana de 18 kilodalton têm até vários mícrons de tamanho.

Pontos no movimento nítido e facilmente identificado do FTS da caixa FT ao vivo mostram que a rede é contínua sem mosaico. A rede de uma proteína maior com um domínio solúvel mais extenso pode ser identificada na pequena tela da coleção de imagens T-E-M-C-C-D e FT são necessários para obter uma melhor avaliação da qualidade da rede, incluindo características como ruído de mosaico no FT de uma protea não ordenada. O lipossomo pode ser confundido com pontos fracos para determinar se os pontos são devidos a pequenos cristais 2D de proteína ou ruído.

Mova a caixa para o pé vivo. Se as manchas desaparecerem imediatamente, elas são ruído, mas se permanecerem inalteradas mesmo em uma pequena área, os cristais provavelmente estão presentes, pois os cristais lipídicos exibem uma morfologia e pés distintos. Esses cristais lipídicos também podem ser reconhecidos pela inspeção visual de uma imagem e tamanhos consistentes de células unitárias.

A precipitação pode ocorrer em tentativas iniciais. A inspeção em alta ampliação é usada para distinguir entre precipitação de proteínas e agregados lipídicos. No caso de agregados lipídicos, a reconstituição pode realmente ter ocorrido e os próximos experimentos exigirão apenas o ajuste dos parâmetros necessários para aumentar o tamanho da membrana e produzir ordem, em vez de induzir a reconstituição em 30.000 a 50.000 x.

As bordas dessas estruturas escuras revelam que elas são compostas de membranas sem proteína. As amostras de precipitação em condições ideais conterão uma grande porcentagem de cristais 2D. Não é necessário buscar uma aparência homogênea das membranas, pois os cristais 2D maiores e mais bem ordenados são selecionados visualmente para a coleta de dados.

Esses tipos de amostras serão facilmente reconhecidos quando a cristalização de tais amostras for usada para coleta de dados crio-EM para resultar no número máximo de imagens de alta resolução. Mostraremos apenas como rastrear cristal 2D de pequenas proteínas de memória por TEM ao fazer este procedimento. É importante lembrar de ser minucioso para não ignorar uma condição de cristalização promissora, pois você já investiu uma quantidade significativa de tempo e esforço até este ponto.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.