Transgénese mosaico Zebrafish de Avaliação Sequências Enhancer

Olá, sou Erica Kgi do laboratório de Shannon Fisher no Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade da Pensilvânia. Eu sou Chris Weber, também do Fisher Lab. E eu sou Shannon Fisher.

Hoje mostraremos um procedimento para analisar a função dos elementos intensificadores usando a transgênese do peixe-zebra. Usamos este procedimento para estudar as regulações transcricionais de genes importantes no desenvolvimento esquelético. Então vamos começar.

Para identificar sequências não codificantes em torno de genes candidatos, usamos o algoritmo fast cons, que pode ser acessado como uma faixa no navegador do genoma uc SC. Estamos interessados principalmente em genes expressos durante o desenvolvimento esquelético, mas a mesma abordagem pode ser usada para estudar quaisquer genes expressos no desenvolvimento inicial. No exemplo mostrado aqui, identificamos sequências conservadas.

No intervalo em torno do gene bumper humano, examinamos todo o intervalo para os genes adjacentes e determinamos um ponto de corte de pontuação logarítmica específico de tamanho baixo correspondente a aproximadamente os 5% superiores da sequência não codificante. Depois de selecionar as sequências, projete os primers usando o primer três para amplificar cada sequência da genômica humana, os primers de DNA devem ser selecionados para amplificar a região conservada mais 30 ou mais pares de bases em ambos os lados. Amplifique a região de interesse com polimerase de alta qualidade usando DNA genômico humano, use procedimentos padrão de biologia molecular de laboratório para clonar o produto amplificado em um vetor de expressão.

O vetor utilizado neste protocolo é o gateway PG wc FOS GFPA. Vetor de destino. Após a criação do vetor disse para transpor.

A enzima necessária para a transposição é primeiro transcrita in vitro usando o kit de máquina M message M da Ambion e o plasmídeo PGB 600 antes das injeções experimentais. Teste a eficácia de cada lote de transposições injetando um intensificador conhecido, como as meias de mouse. 10 potenciador.

Para se preparar para as injeções, puxe as agulhas usadas para microinjeção de vidro capilar de filamento de 1,2 milímetro de diâmetro externo em um extrator de micropipeta Sutter P 97. Use um programa que produza uma ponta forte com um cone afiado para penetrar no córion intacto com uma lâmina de barbear limpa e uma lâmina micrométrica. Quebre as pontas manualmente sob um microscópio estéreo com um diâmetro externo de aproximadamente 15 micrômetros.

As agulhas podem ser armazenadas por um dia em um prato coberto. Mantenha a população de peixes-zebra em um ciclo regular de luz escura com 14 horas de luz em condições padrão no dia anterior à realização de microinjeções. Prepare os peixes para acasalamentos cronometrados em pequenos tanques de reprodução.

Coloque três fêmeas ou dois machos por tanque em fileiras paralelas na manhã das microinjeções, logo após o início do ciclo de luz. Combine machos e fêmeas em água limpa tratada com sistema para a produção de ovos. Verifique os peixes com frequência e colete os ovos alguns minutos após a produção para obter lotes bem sincronizados.

Mantenha a produção de ovos por duas a três horas, continuando a combinar grupos de peixes frescos ao longo da manhã com uma pipeta de vidro de cinco e um quarto de polegada de diâmetro largo equipada com um bulbo de látex. Classifique os embriões coletados em placas de Petri de 60 por 15 milímetros, parcialmente preenchidas com meio embrionário em grupos de 50 embriões. Marque o tempo coletado na tampa de cada prato.

Para cada ninhada de embriões coletados, guardar um prato de 50 embriões para o controle não injetado entre as coletas de ovos. Prepare soluções de injeção frescas misturando os seguintes ingredientes em um tubo de microfuga e guarde com gelo. Coloque as agulhas de injeção em pratos de retenção e encha com 1,5 a dois microlitros de solução de injeção.

Pipetando gotas de 500 nanolitros na extremidade larga de cada agulha. O líquido será puxado para a ponta por ação capilar. Prepare pelo menos duas agulhas para cada solução injetável.

Carregue a agulha cheia no porta-agulha portátil de uma bomba pneumática pico ou injetor de pressão semelhante. Configurado e conectado a um tanque de nitrogênio de acordo com as instruções do fabricante. Calibre os volumes de injeção medindo o diâmetro das gotículas expelidas em óleo mineral em uma lâmina micrométrica, normalmente um tempo de injeção de 120 milissegundos.

Com uma pressão de 20 PS, produzirei uma gota de aproximadamente um nanolitro usando um microscópio estéreo com ampliação de seis a 10 x. Segure o embrião no lugar com um par de pinças finas e empurre a agulha de injeção com pressão constante através do córion para a gema de um embrião no estágio de uma célula ou duas células, posicione a ponta da agulha na gema logo abaixo dos blastômeros, expela aproximadamente um litro de solução de injeção e retire a agulha para cada construção que injetamos maior ou igual a 200 embriões após a conclusão da injeção. Separe os embriões removendo óvulos não fertilizados, embriões danificados e injeções fracassadas ou embriões sem vermelho de fenol nos blasfemadores.

Em seguida, incubamos os embriões e o meio embrionário a 28,5 graus Celsius até o momento apropriado para as observações. Agora mostraremos alguns resultados representativos de elementos intensificadores que produzem padrões específicos de expressão de GFP no embrião de peixe-zebra. Estudamos genes expressos em osso ou cartilagem durante.

Aqui está um exemplo de um elemento intensificador a montante do gene acan que regula a expressão na cartilagem facial craniana três dias após a fertilização. Aqui está outro intensificador, desta vez do gene bumper que regula a expressão nas células ósseas. Em cinco dias dos muitos intensificadores que identificamos, encontramos pouca correlação entre a localização em relação ao gene e a regulação da expressão.

Ao escolher sequências para testar, é importante lembrar que um intensificador pode estar centenas de quilobases a montante ou a jusante de um gene ou em um dos íntrons, como visto neste embrião. Uma parte substancial das sequências não parece regular a expressão específica do tecido. Estes geralmente mostram muito pouca fluorescência ou podem ter algumas células dispersas em dois locais comuns para expressão ectópica, a epiderme e o músculo esquelético.

Acabamos de mostrar como identificar potenciais elementos potenciadores por meio da conservação de sequências e testar sua função por meio da transgênese em mosaico no peixe-zebra. Ao fazer este procedimento, é importante examinar a qualidade do seu DNA e RNA para injeções. Certifique-se também de examinar cuidadosamente todos os seus embriões injetados, especialmente se você espera expressão apenas em um pequeno grupo de vendas.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.