EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

A triagem de genes associados ao ciclo celular por RNA AI começa com a escolha de uma missão de tecnologia de knockdown apropriada. Fácil. As bibliotecas de RNA da Sigma Aldridge fazem uso da alta eficiência e especificidade da endo ribonuclease preparada si. Um RNAs fácil são pools complexos de RNAs SI individuais, preparados por digestão enzimática de RNA de fita dupla longa, complementares ao pool MNA alvo de RNAs SI direcionados ao mesmo transcrito, aumenta a especificidade e evita a busca trabalhosa por RNAs SI individuais eficientes e específicos.

Isso torna o RNA fácil especialmente adequado para telas de perda de função em grande e média escala. Aqui mostramos as etapas necessárias para realizar uma triagem ocular de RNA em larga escala, desde a configuração do transfecto de alto rendimento até o desenvolvimento de um ensaio apropriado. Isso é exemplificado pela criação de uma triagem para genes envolvidos na progressão do ciclo celular de mamíferos.

Primeiro, mostramos como a transfecção de células hilares é otimizada, seguida pela avaliação estatística da qualidade do ensaio. Finalmente, uma tela em escala de genoma é realizada medindo a distribuição do ciclo celular após a depleção do gene alvo. Os acertos são selecionados usando a estatística zco e verificados por RNAs fáceis independentes secundários.

Além disso, descrevemos possíveis procedimentos experimentais que podem ser usados para acompanhar a triagem ocular de RNA. Olá, sou Ty do Instituto Max Plank de Biologia Celular Molecular e Genética. E Tristão.

Eu sou Frank Al, também do Instituto Marx Plunk em Dresden. Hoje mostraremos um procedimento para configurar uma tela de perda de função em células de mamíferos utilizando RNAs de missão fácil da Sigma Aldridge. Um ensaio para medir a distribuição do ciclo celular em uma população de células de cultura de tecidos será usado como exemplo para demonstrar como os genes podem ser ligados ao processo biológico usando triagem de RNAi.

Então vamos começar. Todo projeto de triagem de RNAi começa com uma escolha de gatilhos de silenciamento, empregados endo ribonuclease preparados si, RNAs ou RNAs fáceis para abreviar são gerados pela digestão enzimática limitada de RNA de fita dupla longa usando RNAs três. Cada RNA fácil é verificado quanto à identidade por sequenciamento e quanto à pureza pela análise de chips de laboratório de paquímetro.

O agrupamento de siRNAs individuais, todos direcionados ao mesmo transcrito, aumenta a especificidade porque cada irna no pool compartilha o mesmo no alvo, enquanto os efeitos fora do alvo são diluídos. Portanto, os RNAs fáceis têm boa eficácia de silenciamento e alta especificidade do alvo, evitando efeitos fora do alvo. Escala do genoma fácil.

As bibliotecas de RNA são fornecidas pela Sigma Aldrich. Em 384, as placas de poços com a borda estão vazias. Além disso, oito posições no centro da placa são deixadas vazias para controles.

Subbibliotecas de RNAs fáceis são fornecidas em placas de 96 poços com todos os poços ocupados aqui, os clientes podem decidir como os RNAs fáceis serão dispostos nessas placas. RNAs fáceis individuais são fornecidos em tubos únicos. A transfecção de RNA fácil requer otimização para diferentes reagentes de transfecção e linhagens celulares.

Aqui curam nossas células cultivadas seguindo procedimentos padrão e oligo como reagente de transfecção é usado. Use a proteína motora de cinesina EEG cinco E-Z-R-N-A-A necessária para a montagem do fuso bipolar como controle positivo e execute o RNA fácil de luciferase como controle negativo. Em uma placa de 384 poços, titule diferentes quantidades de RNA fácil, por exemplo, de um nanograma a 56 nanogramas com um incremento de cinco nanogramas e quantidades crescentes de reagente de transfecção de 0,1 microlitros para 0,9 microlitros com um incremento de 0,05 microlitros.

Depois de misturar o RNA e o reagente de transfecção, adicione as células e incube por 48 horas. Quando o período de incubação terminar, verifique as células em um microscópio óptico. Conte as células transfectadas com eeg.

Cinco RNAs fáceis que mostram uma forma redonda indicativa de mitótico. O resto também conta o número total de células transfectadas com um controle negativo. Gran vanilla luciferase RNA fácil.

A condição ideal de transfecção mostra a menor toxicidade para a luciferase baunilha e o fenótipo mais pronunciado para EEG cinco. Agora que os parâmetros de transfecção estão otimizados, prossiga para configurar e tela primária. Estações de pipetagem automatizadas, como Matrix Wellm Mate ou Tecan Aquarius, usadas para preparar as telas primárias, devem ser colocadas sob a capela de fluxo da lâmina para evitar contaminação.

Todos os componentes usados devem ser higienizados antes do uso, seja por autoclavagem, se aplicável, ou por pulverização com etanol a 75% antes da tela. Esses instrumentos devem ser otimizados de acordo com os protocolos do fabricante. Otimize a precisão da pipetagem para todos os componentes usados na estação de pipetagem automatizada, pois os parâmetros de pipetagem mudam dependendo do tipo de solução, volume e tipo de placa.

Essa otimização deve ser repetida para cada etapa separadamente. Além disso, otimize os protocolos de lavagem para que a contaminação cruzada de poço a poço seja excluída quando as estações de pipetagem automatizadas estiverem prontas. Transfectar células em formato de 384 poços usando as condições otimizadas previamente determinadas para garantir que nenhum efeito de posição seja observado.

Use RNAs fáceis para EEG cinco e luciferase baunilha com um padrão alternado cobrindo toda a placa. Deixe todos os poços de borda vazios, pois um problema comum ao usar placas de vários poços é a evaporação aprimorada nos poços de borda durante o tempo de incubação. Isso leva a diferentes condições experimentais em diferentes poços, o que geralmente se traduz em efeitos de posição da placa para minimizar ainda mais a evaporação, barreiras de evaporação de funcionários, como Corning, fita de teto respirável.

Certifique-se também de que as incubadoras sejam mantidas em alta umidade. No entanto, lembre-se de que existem as fontes possíveis para efeitos de posição, como variação no manuseio de líquidos ou no sistema de leitura, como um leitor de placas. Após incubação por 48 horas, fixe as células com gelo frio, 100% de etanol por duas horas e depois reidratar em PBS por 15 minutos.

Manchar as células fixas por 25 minutos em PBS contendo um micrograma por mililitro de DPI e 100 microgramas por mililitro de RNAs. Finalmente, lave três vezes com PBS e armazene a quatro graus Celsius. Em seguida, meça a intensidade da fluorescência DPI por microscopia.

Um sistema de scanner Olympus é usado aqui para cada um. Examine bem as células e determine a intensidade relativa do DPI. Gere um histograma plotando a intensidade do DPI em relação ao número de células com base no histograma.

Avalie a distribuição do ciclo celular calculando a porcentagem de células com conteúdo de DNA A, dois N para G, uma fase zero G, entre dois N e quatro, N para fase S quatro, N para G, duas fases MPH e maior que quatro, N para aneuploidia ou poliploidia. Para avaliar a homogeneidade dos resultados sobre a placa, comparar a distribuição do ciclo celular entre os diferentes poços, comparando a porcentagem de células na fase G dois M para o EEG cinco e transfecto de luciferase se os resultados diferirem significativamente sobre a placa, é necessária uma otimização adicional para eliminar os efeitos de posição. Uma vez satisfeita com a consistência dos resultados, calcule as diferenças estatísticas entre os controles positivo e negativo.

Use a equação do fator Z mostrada aqui para determinar a significância estatística dos resultados. SD significa desvio padrão e AV significa média. Um fator Z entre um e 0,5 indica uma separação estatisticamente significativa entre controles negativos e ruído dos controles positivos.

Se tal diferença estatística foi estabelecida, pode-se prosseguir para a triagem primária. Prepare 384. Placas de cultura de tecidos de poço para transfecção de RNAs fáceis utilizando as condições otimizadas predeterminadas aqui.

15 nanogramas de RNA fácil por poço são dissolvidos em cinco microlitros de tampão TE. Pelo menos oito posições de controle por placa são carregadas com controles positivos e negativos adequados para o processo biológico. Estudei aqui, EEG cinco e ranil luciferase.

RNAs fáceis são usados para evitar efeitos de posição. Os poços de borda são carregados apenas com cinco microlitros de tampão TE. Em seguida, adicione cinco microlitros de opti MEM contendo 0,2 microlitros de oligo por mistura de poço e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.

Depois de misturar o RNA com o reagente de transfecção, adicione a suspensão celular aqui. 40 microlitros de uma suspensão de células R são adicionados a uma concentração de 25 células por microlitro, equivalente a 1000 células por poço, incubar por 72 horas. Após as 72 horas de incubação.

Meça o conteúdo de DNA em um microscópio automatizado, como o Olympus scan R, conforme mostrado anteriormente. Repita este procedimento para todas as placas da biblioteca para seleção de ocorrências. Avalie os valores do conteúdo de DNA usando estatísticas de escore Z.

Observe que o escore Z não é o mesmo que o escore Z do fator Z. Forneça uma medida estatística para a significância do valor da amostra em comparação com um controle negativo ou simulado. É calculado seguindo a equação mostrada aqui.

Calcule o zco para todas as amostras fáceis de RNA usando o sinal para o controle negativo da luciferase de baunilha como referência para a seleção de acertos, um limite deve ser aplicado. Normalmente, um critério de significância para Z maior que dois ou menor que menos dois é usado. No entanto, dependendo do processo biológico estudado ou do escopo da triagem, diferentes limites podem ser aplicados.

Métodos de avaliação matemática mais elaborados, como o Q, também podem ser usados para seleção de acertos. Em seguida, os acertos selecionados são submetidos a uma tela secundária e validação HIIT. Uma triagem secundária dos genes HIIT selecionados segue a triagem primária para eliminar falsos positivos devido à variação experimental.

Primeiro, verifique os acertos selecionados usando o mesmo procedimento da tela primária, exceto configurar os acertos com um número maior de repetições entre três e cinco para permitir uma melhor avaliação estatística. Para os acertos verificados, use o mesmo ensaio e leitura da tela primária, mas com um RNA fácil secundário não sobreposto ou outro gatilho silenciador não sobreposto, como um si sintetizado quimicamente. RNA Em última análise, valida os genes selecionados por espécies cruzadas.

O RNAI resgata o padrão-ouro para a verificação de fenótipos de RNAi disponíveis até o momento. Em suma, um cromossomo artificial bacteriano abreviado de volta que codifica um orto log de uma espécie diferente do gene selecionado é transfectado de forma estável em células. As construções posteriores preservam um gene em seu contexto genômico e permitem uma expressão quase fisiológica.

O RNAi contra o gene endógeno deixará a expressão do transgene orto inalterada, o que resgata o fenótipo do RNAi. Finalmente, os candidatos validados estudaram com mais detalhes para eventualmente obter uma compreensão mecanicista. Em muitos casos, o RNAi também pode ser usado nesses ensaios secundários mais elaborados.

Por exemplo, microscopia de lapso de tempo de fenótipos de RNAi. Aqui está um exemplo de uma tela de ciclo celular na qual o conteúdo de DNA das células R de cura foi medido após o knockdown de mais de 16.000 genes do genoma humano. 1.351 ocorrências primárias foram identificadas como necessárias para a divisão celular.

Na triagem secundária, 743 acertos foram verificados com um gatilho de RNA fácil independente secundário usando um ensaio secundário. Os knockdowns que resultaram em uma parada G dois foram separados dos knockdowns que resultaram em parada mitótica. Finalmente, em todas as espécies de experimento de resgate ocular de RNA para o gene, Lin 54 foi usado para validar seu papel na divisão celular adequada.

Outros experimentos a jusante mostraram que a depleção de Lin 54 alterou a expressão de muitos genes do ciclo celular. Acabamos de mostrar como configurar a transfecção de missão de alto rendimento, RNAs fáceis e análise da distribuição do ciclo celular na linha celular de cultura de tecidos humanos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que as condições de transfecção e os ensaios devem ser otimizados separadamente para qualquer sistema celular e qualquer processo biológico.

O uso de sistemas automatizados de manuseio de líquidos é recomendado, mas não indispensável, especialmente para telas de pequena escala. O manuseio manual também é viável. Então é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.