Name: EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Aprenda a realizar triagem de esiRNA em larga escala para identificar genes do ciclo celular em células de mamíferos. Este método utiliza bibliotecas humanas de alta especificidade para silenciamento gênico eficiente.

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Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório Buchholz eo Sigma-Aldrich RNAi-time para a discussão. Gostaríamos de agradecer ao Max Planck Society eo Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] para suporte. MISSÃO ® é uma marca registrada da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich

1. Alta qualidade esiRNA bibliotecas MISSÃO <ol><li> Para cada gene de interesse da região-alvo mais sensíveis e específicas para RNAi é escolhido utilizando o algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). Quatro pontuações DEQOR o potencial silenciamento de todas as possível 21 nucleotídeos siRNAs longos em um alvo mRNA baseada em state-of-the-art design 4 restrições. Além disso, cada siRNA potencial é analisado para possível reatividade cruzada com outros genes através da realização de uma pesquisa BLAST contra o transcriptoma do organismo estudado. O programa fornece, assim, uma análise da qualidade global e cross-silenciamento capacidades dos esiRNA potencial (300-600 duração bp). </li><li> A região escolhida do alvo gene-cDNA é amplificado por PCR usando primers gene-específicos flanqueado por RNA-polimerase bacteriófago promotor-seqüências. </li><li> Cada produto de PCR utilizado para a produção esiRNA MISSÃO é verificada a identidade através do seqüenciamento e análise de pureza, Caliper Labchip. </li><li> Long double-stranded RNA é transcrito a partir do PCR-RNA polimerase produto, seguido de um recozimento dos fios transcritas. </li><li> esiRNAs são preparados por digestão enzimática limitada do long double-stranded RNA usando RNaseIII seguidos de purificação através de cromatografia de troca aniônica, utilizando colunas de Q-sepharose spin. </li><li> esiRNAs são precipitadas e ressuspendidas em tampão TE. O rendimento é medido pela absorção de UV-medições ea concentração é ajustada pela dissolução em um volume adequado de tampão TE. A qualidade global do produto final está marcada pela Caliper análise Labchip. </li></ol> 2. Escolhendo uma linha celular e otimização de transfecção para a seleção <ol><li> Titular quantidades de esiRNA (use EG5 como positivo e renilla-luciferase como controle negativo) e quantidades crescentes de reagentes de transfecção em uma placa de 384 poços, adicionar células e incubar por 48 horas. EG5 é uma proteína do motor kinesin necessários para a montagem do eixo bipolar e esgotamento leva a uma paragem da mitose. Repita este procedimento para os reagentes de transfecção e diferentes linhagens celulares. Aqui, usamos células HeLa cultivadas seguindo procedimentos padrão e oligofectamine (Invitrogen) como reagente de transfecção. </li><li> Para a escolha das condições ideais de transfecção contar as células transfectadas com EG5 esiRNAs que mostram uma paragem da mitose (forma arredondada) eo número total de células transfectadas com renilla-luciferase esiRNA (RLUC) por microscopia de luz. Escolha o estado com a menor toxicidade para RLUC eo fenótipo mais pronunciada para EG5. Um método alternativo para otimização das condições de transfecção envolve uma linha celular estável expressando EGFP (ou outro gene repórter adequados) sob o controle de um promotor constitutivo ativo. Após a transfecção de um esiRNA contra EGFP (ou outro gene repórter) e RLUC (ou outro esiRNA controle adequado negativo) eficácia medida knock-down e toxicidade por separação de células por exemplo fluorescência assistida (FACS). Certifique-se que o esiRNA usado para EGFP é totalmente complementar ao mRNA-alvo. </li></ol> 3. Configurando a tela de 5,6 Primária <ol><li> Otimizar a precisão de pipetagem para todos os componentes usados ​​em uma estação de pipetagem automática (por exemplo, Aquarius, Tecan e WellMate, Matrix). Porque os parâmetros de pipetagem mudar, dependendo do tipo de tipo de volume de solução, ea placa esta otimização tem que ser repetido para cada etapa separadamente. Se possível, a estação de pipetagem deve ser colocado sob uma capela de fluxo laminar para evitar contaminações. Todos os componentes utilizados devem ser higienizados antes do uso, quer em autoclave, se aplicável, ou por aspersão com etanol 75%. Otimizar protocolos de lavagem, para que a contaminação cruzada de bem para o bem é excluído. Detalhes para a otimização de pipetagem automática não pode ser dar para o espaço-constrangimentos e dependem em grande parte da estação de pipetagem utilizada. Para mais informações consulte a fabrica de protocolo. </li><li> Transfecção de células em formato de 384 poços, utilizando as condições otimizadas de cima com esiRNAs para EG5 e RLUC. Use um padrão alternado para EG5 e esiRNA RLUC cobrindo toda a placa. </li><li> Após a incubação por 48 horas fixar as células com 100% de etanol frio, hidratar em PBS por 15 minutos, mancha por 25 minutos em PBS contendo 1 mg / ml DAPI e 100 mg / ml de RNase A (Qiagen). Finalmente, lavar com PBS e armazenar a 4 ° C. </li><li> Medida de intensidade de fluorescência de DAPI-por exemplo, em um sistema de microscopia ScanR Olympus. Gerar um histograma de intensidade por conspirar contra o DAPI número de células e avaliar a distribuição do ciclo celular através do cálculo do percentual de células com o DNA 2N conteúdo para a fase G1; &lt;2N&gt; 4N para S-fase; 4N para G2/M-phase e &gt; 4N para aneuploidia / poliploidia. </li><li> Avaliar a homogeneidade dos resultados sobre a placa. Otimização é necessária se os resultados diferem significativamente para excluir effe posiçãocts. Um problema comum quando se utiliza multi-placas é bem maior evaporação nos poços vantagem durante o tempo de incubação. Isto leva a diferentes condições experimentais em poços diferentes, que muitas vezes se traduz em placa-position efeitos específicos. Por este motivo, recomendamos deixar todos os poços borda vazia para uma tela. Para minimizar ainda mais a evaporação se certificar de que as incubadoras são mantidos em umidade alta. Nós também rotineiramente empregam barreiras evaporação, como Corning A fita de vedação respirável que bloqueiam a evaporação. Recursos também outros para efeitos da posição tem que ser levados em consideração, por exemplo, variação da técnica do sistema de leitura (microscópio leitor de placas, etc) ou variações de manipulação de líquidos (gradientes, heterogeneidade de soluções, etc). </li><li> As diferenças estatísticas entre os controles positivos e negativos fornecer uma medida para a importância do doseamento utilizados. A grande diferença entre o controle negativo (ou ruído de fundo; mock-controle) e da amostra tem de ser estabelecida antes de iniciar o rastreio real. Uma boa medida para a significância estatística é o factor-Z. O Z-fator é calculado segundo a equação: Z = 1 - (3 SD [amostra] + 3 SD [simulação]) * (| Av. [amostra] - Av. [simulação] |) -1; com SD: desvio padrão; Av: média. A Z-fator de 1&gt; Z&gt; 0,5 indica uma separação estatisticamente significativa de controles negativos (e ruído) dos controles positivos 7. </li></ol> 4. Tela principal <ol><li> Prepare 384 poços placas de cultura de tecidos para a transfecção de esiRNAs utilizando as condições otimizadas de cima. Aqui, usamos esiRNA 15ng por poço dissolvido em 5μl tampão TE. Pelo menos oito posições de controle por placa deve ser carregado com adequados controles positivos e negativos para o processo biológico em estudo (aqui: EG5 e RLUC). Para evitar efeitos de borda posição dos poços são carregados com 5μl tampão TE apenas. </li><li> Adicionar 5μl OptiMEM (Invitrogen) contendo Oligofectamine 0.2μl por poço, misturar e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar suspensão celular sobre a mistura de transfecção (aqui: 40μl de uma suspensão de células HeLa a 25 células / mL de concentração; equivalente a 1.000 células por poço) e incubar por 72 horas. </li><li> Medida DNA de conteúdo em um microscópio automatizado (Olympus ScanR, veja acima). Avaliar usando Z-score estatísticas para a seleção hit: Z-scores são calculados para todos os esiRNAs amostra usando o sinal para o controle negativo como referência. Nota, o Z-score não é o mesmo que o factor-Z. Z-scores fornecem uma medida estatística de significância dos valores da amostra em comparação com um controle (mock-). É calculado de acordo com a equação: Z = (valor [Sample] - média [simulação]) * desvio-padrão [simulação] -1. Para a seleção bateu um limite tem de ser aplicado. Tipicamente, um critério de importância, como: 2 &lt;Z &lt;-2 é usado, mas dependendo da qualidade do conjunto de dados, o estudo processo biológico ou simplesmente o escopo da tela, diferentes limiares podem ser aplicáveis. Ao lado do razoavelmente fácil Z-score estatísticas também mais elaboradas métodos de avaliação matemática pode ser usada (a primeira no interior amplo campo de avaliação estatística de dados de rastreio podem ser encontrados em Malo et al. 8). </li></ol> 5. Tela secundária e validação hit <ol><li> A tela secundária segue a tela principal para eliminar falsos positivos devido a erros experimentais ou fora do alvo efeitos. Para os hits selecionados o mesmo procedimento utilizado na tela principal deve ser repetido para um número maior de repetições (3-5) para permitir uma melhor avaliação estatística. </li><li> Por sucessos verificados um esiRNA secundário que não se sobrepõem (ou outro gatilho silenciamento não sobrepostos) contra os alvos identificados nas telas iniciais devem ser utilizados. Mesmo ensaio e leia-out deve ser aplicada como para a tela principal. </li><li> Em última análise, os genes selecionados podem ser validadas pelo cross-espécies de resgate RNAi 9. Assim, um cromossomo bacteriano artificial codificação (BAC) por exemplo, o rato ortólogo do gene é estavelmente transfectadas em células. BAC-construções de preservar um gene em seu contexto genômico e permitir uma expressão quase-fisiológica. RNAi contra o gene endógeno humano vai deixar a expressão do transgene rato inalterada que resgata a RNAi-fenótipo. RNAi-resgate fornece o padrão-ouro para a verificação de fenótipos RNAi disponíveis até à data. </li><li> Finalmente, os candidatos validados são estudados em mais detalhes para finalmente obter a compreensão mecanicista. Em muitos casos RNAi pode ser usado nesses experimentos, por exemplo, no secundário, testes mais elaborados. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Autores declaram relações financeiras com entidades comerciais que possam ter interesse no trabalho apresentado.

Interferência de RNA tem se tornado uma técnica padrão para o estudo de perda de função-fenótipos. Grande escala coleções de RNAi-mediadores estão disponíveis a partir de diferentes fornecedores e fornecer um método fácil, econômico e rápido para silenciamento de genes. Este abriu o portão para a triagem sistemática para atores-chave em muitos processos biológicos que permite uma perspectiva de escala do genoma em uma ampla gama de diferentes espécies e tipos de células. Alta de falsos positivos e falsos negativos são as taxas de um desafio comum em telas de RNAi. Para resolver este problema, esforços consideráveis ​​foram investidos para melhorar a eficácia e, em particular a especificidade do silenciamento triggers. Uma descoberta importante foi que um grupo de siRNAs diferentes visando a transcrição mesma aumenta muito a especificidade alvo. Porque uma piscina muito complexa de diferentes siRNAs é produzido pela endoribonuclease, esiRNAs são gatilhos alta especificidade alvo, reduzindo a taxa de falsos positivos em telas de RNAi. esiRNAs também demonstraram para atingir knockdowns eficiente, reduzindo também a taxa de falso negativo. Porque as telas de RNAi são tecnicamente exigentes, que provavelmente permanecerá desafiador para realizar de forma rotineira por algum tempo. No entanto, como reagentes e instrumentos de laboratórios obter melhor e mais compartilhar seus conhecimentos, o uso de telas de RNAi na biologia moderna são considerados para aumentar no futuro.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Para obter informações adicionais, entre em contato: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita selante respirável</td><td>Corning</td><td>Fita Selante Respirável, Estéril (Produto #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Etanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 graus (absoluto), para biologia molecular</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Solução salina tamponada com fosfato&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Reagente Bio, concentrado 10x, adequado para cultura celular, para biologia molecular</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-Diamidino-2-fenilindol di-hidrocloridrato&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Pó, Reagente Bio, adequado para cultura celular, &amp;gt;98% (CLAE e CCF)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A do pâncreas bovino&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Para biologia molecular, &amp;#8805;70 unidades Kunitz/mg de proteína, pó liofilizado</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Solução tampão Tris-EDTA&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, para biologia molecular</td></tr></tbody></table>

esirna missÃo para a seleção rnai em células de mamíferos

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo básico celular para o controle da expressão gênica. RNAi é induzida por curto double-stranded RNA também conhecido como pequenos RNAs de interferência (siRNAs). A curto double-stranded RNA provenientes de mais de casal precursores presos pela atividade de Dicer, uma proteína da família III RNase de endonucleases. Os fragmentos resultantes são componentes do RNA induzida silenciamento complexos (RISC), direcionando-a para o mRNA alvo cognato. RISC cliva o mRNA alvo, reduzindo assim a expressão da proteína codificada 1,2,3. RNAi tem se tornado um método poderoso e amplamente utilizado experimental para a perda de estudos a função do gene em células de mamíferos utilizando pequenos RNAs de interferência. Atualmente dois métodos principais estão disponíveis para a produção de pequenos RNAs de interferência. Um método envolve a síntese química, ao passo que um método alternativo emprega clivagem endonucleolítica de alvo específico long double-stranded RNA pela RNase III in vitro. Assim, uma piscina diversificado de siRNA-like oligonucleotides é produzido, que é também conhecido como endoribonuclease preparados siRNA ou esiRNA. Uma comparação da eficácia dos siRNAs quimicamente derivados e esiRNAs mostra que ambos os gatilhos são potentes no alvo gene-silenciamento. Diferenças podem, no entanto, ser visto quando se compara especificidade. Muitos única siRNAs sintetizados quimicamente produzem proeminente fora do alvo os efeitos, enquanto que a mistura complexa inerente esiRNAs leva a um knockdown mais específico 10. Neste estudo, nós apresentamos o projeto do genoma escala bibliotecas MISSÃO esiRNA e sua utilização para RNAi triagem exemplificado por uma tela de DNA de conteúdo para a identificação de genes envolvidos na progressão do ciclo celular. Vamos mostrar como otimizar o protocolo de transfecção e no teste de triagem em alta taxa de transferência. Também demonstramos como grande conjuntos de dados podem ser avaliados estatisticamente e apresentar métodos para validar visitas primária. Finalmente, damos potenciais pontos de partida para outras caracterizações funcionais de visitas validado.

Aqui usamos uma biblioteca esiRNA humanos em uma tela de high-throughput de genes envolvidos na divisão celular. Demonstramos como configurar e realizar uma esiRNA telas, bem como a forma de analisar e validar os resultados.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo celular básico para o controle da expressão gênica. A RNAi é induzida por RNAs curtos de fita dupla, também conhecidos como ...

A triagem de genes associados ao ciclo celular por RNAi começa com a escolha de uma tecnologia de silenciamento adequada, como a missão.Easy. As bibliotecas de RNAi da Sigma-Aldrich utilizam a alta eficiência e especificidade do siRNA preparado por endorribonuclease. Os RNAsi Easy são pools complexos de siRNAs individuais, preparados por digestão enzimática de RNA de fita dupla longo, complementar ao RNA mensageiro alvo. O agrupamento de siRNAs direcionados ao mesmo transcrito aumenta a especificidade e evita a busca trabalhosa por siRNAs individuais eficientes e específicos.Isso torna o RNA de interferência especialmente adequado para telas de perda de função em larga e média escala. Aqui mostramos os passos necessários para realizar uma tela em larga escala de RNA para o olho, começando pela configuração da transfeção de alto rendimento até o desenvolvimento de um ensaio apropriado. Isso é exemplificado pela montagem de uma tela para genes envolvidos na progressão do ciclo celular de mamíferos.Primeiro, demonstramos como a transfeção de células hilares é otimizada, seguida pela avaliação estatística da qualidade do ensaio. Finalmente, é realizada uma triagem em escala genômica medindo a distribuição do ciclo celular após o esgotamento do gene alvo. Os acertos são selecionados utilizando a estatística zco e verificados por RNAs fáceis independentes secundários.Além disso, descrevemos procedimentos experimentais potenciais que podem ser utilizados para complementar a triagem de RNA ocular. Olá, sou Ty do Instituto Max Plank de Biologia Celular e Genética Molecular. E Tristan.Sou Frank Al, também do Instituto Marx Plunk em Dresden. Hoje vamos mostrar um procedimento para montar uma tela de perda de função em células de mamíferos utilizando RNAs fáceis Mission da Sigma Aldridge. Um ensaio para medir a distribuição do ciclo celular em uma população de células de cultura de tecidos será usado como exemplo para demonstrar como genes podem ser associados a processos biológicos utilizando triagem por RNAi.Então vamos começar. Todo projeto de triagem por RNAi inicia com a escolha dos agentes de silenciamento. Os siRNAs preparados com ribonucleases endógenas, ou easy RNAs (eRNAs), são gerados por digestão enzimática limitada de RNA de fita dupla longo utilizando RNAs três. Cada eRNA é verificado quanto à identidade por sequenciamento e quanto à pureza por análise no chip do equipamento Caliper Lab.A agrupamento de siRNAs individuais que visam todos o mesmo transcrito aumenta a especificidade, pois cada irna no grupo compartilha o mesmo alvo direto, enquanto os efeitos fora do alvo são diluídos. Portanto, os easy RNAs apresentam boa eficácia de silenciamento e alta especificidade para o alvo, evitando efeitos fora do alvo. Escala genômica easy.As bibliotecas de RNA são fornecidas pela Sigma Aldrich. Em placas de 384 poços, com os poços das bordas vazios. Além disso, oito posições no centro da placa são deixadas vazias para controles.Subbibliotecas de easy RNAs são fornecidas em placas de 96 poços, com todos os poços ocupados; os clientes podem decidir como os easy RNAs serão dispostos nessas placas. Os easy RNAs individuais são fornecidos em tubos simples. A transfeção de easy RNA requer otimização para diferentes reagentes de transfeção e linhagens celulares.Aqui, cultivamos nossas células seguindo procedimentos padrão e utilizamos oligo como reagente de transfeção. Utilize EEG cinco E-Z-R-N-A-A, uma proteína motora de quitina necessária para a montagem do fuso bipolar, como controle positivo, e ran luciferase easy RNA como controle negativo. Em uma placa de 384 poços, faça titulações com diferentes quantidades de easy RNA, por exemplo, de um nanograma a 56 nanogramas com incrementos de cinco nanogramas, e quantidades crescentes de reagente de transfeção de 0,1 microlitro a 0,9 microlitro com incrementos de 0,05 microlitro.Após misturar o RNA e o reagente de transfeção, adicione as células e incube por 48 horas. Quando o período de incubação terminar, examine as células sob um microscópio óptico. Conte as células transfectadas com eeg.Cinco RNAs fáceis que apresentam uma forma arredondada indicativa de mitose. Contar também o número total de células transfectadas com um controle negativo. RNA fácil de luciferase de baunilha granulada.A condição ideal de transfeção apresenta a menor toxicidade para a luciferase de baunilha e o fenótipo mais acentuado para EEG cinco. Agora que os parâmetros de transfeção foram otimizados, prossiga para a montagem e a triagem primária. Estações automatizadas de pipetagem, como a Matrix Wellm Mate ou a Tecan Aquarius, utilizadas para preparar as triagens primárias, devem ser colocadas sob capela de fluxo laminar para evitar contaminação.Todos os componentes utilizados devem ser sanitizados antes do uso, seja por autoclavação, se aplicável, ou por pulverização com etanol a 75% antes da triagem. Esses instrumentos devem ser otimizados de acordo com os protocolos do fabricante. Otimize a precisão da pipetagem para todos os componentes utilizados na estação de pipetagem automatizada, pois os parâmetros de pipetagem variam conforme o tipo de solução, volume e tipo de placa.Essa otimização deve ser repetida para cada etapa separadamente. Além disso, otimize os protocolos de lavagem para que a contaminação cruzada de poço a poço seja excluída quando as estações de pipetagem automatizadas estiverem prontas. Transfete as células no formato de 384 poços utilizando as condições otimizadas previamente determinadas para garantir que nenhum efeito de posição seja observado.Utilize RNAs fáceis para EEG cinco e luciferase de luciferina com um padrão alternado cobrindo toda a placa. Deixe todos os poços das bordas vazios, pois um problema comum ao usar placas de múltiplos poços é a evaporação aumentada nos poços das bordas durante o tempo de incubação. Isso leva a condições experimentais diferentes em poços distintos, o que frequentemente se traduz em efeitos de posição na placa; para minimizar ainda mais a evaporação, utilize barreiras contra evaporação, como fita vedante respirável da Corning.Também certifique-se de que os incubadores sejam mantidos com alta umidade. No entanto, lembre-se de que existem fontes possíveis de efeitos de posição, como variações no manuseio de líquidos ou no sistema de leitura, por exemplo, um leitor de placas. Após a incubação por 48 horas, fixe as células com etanol a 100%, gelado, por duas horas e, em seguida, reidrate em PBS por 15 minutos.Incube as células fixadas por 25 minutos em PBS contendo um micrograma por mililitro de DPI e 100 microgramas por mililitro de RNAs. Em seguida, lave três vezes com PBS e armazene a quatro graus Celsius. Em seguida, meça a intensidade da fluorescência de DPI por microscopia.Um sistema de scanner Olympus é utilizado aqui para cada um. Examinaremos as células e determinaremos a intensidade relativa de DPI. Gere um histograma plotando a intensidade de DPI contra o número de células com base no histograma.Avalie a distribuição do ciclo celular calculando a porcentagem de células com conteúdo de DNA 2N para a fase G0/G1, entre 2N e 4N para a fase S, 4N para a fase G2/M e maior que 4N para aneuploidia ou poliploidia. Para avaliar a homogeneidade dos resultados ao longo da placa, compare a distribuição do ciclo celular entre os diferentes poços comparando a porcentagem de células na fase G2/M para o EEG5 e a transfeção com luciferase; se os resultados diferirem significativamente ao longo da placa, será necessária uma otimização adicional para eliminar efeitos de posição. Após ficar satisfeito com a consistência dos resultados, calcule as diferenças estatísticas entre os controles positivo e negativo.Utilize a equação do fator Z mostrada aqui para determinar a significância estatística dos resultados. SD representa o desvio padrão e AV representa a média. Um fator Z entre um e 0,5 indica uma separação estatisticamente significativa entre os controles negativos e o ruído em relação aos controles positivos.Se essa diferença estatística tiver sido estabelecida, pode-se prosseguir para a triagem primária. Prepare placas de cultura de tecidos de 384 poços para a transfeção de RNAs simples utilizando as condições otimizadas previamente determinadas aqui.Quinze nanogramas de RNA fácil por poço são dissolvidos em cinco microlitros de tampão TE. Pelo menos oito posições de controle por placa são carregadas com controles positivos e negativos apropriados para o processo biológico. Estudados aqui, EEG cinco e ranil luciferase.Os RNAs fáceis são utilizados para evitar efeitos de posição. Os poços das bordas são carregados apenas com cinco microlitros de tampão TE. Em seguida, adicione cinco microlitros de opti MEM contendo 0,2 microlitro de oligo por mistura de poço e incube por 20 minutos à temperatura ambiente.Após misturar o RNA com o reagente de transfeção, adicione a suspensão celular aqui. 40 microlitros de uma suspensão de células he R são adicionados com concentração de 25 células por microlitro, equivalente a 1000 células por poço, e incubados por 72 horas. Após a incubação de 72 horas.Meça o conteúdo de DNA em um microscópio automatizado, como o Olympus scanR, conforme mostrado anteriormente. Repita este procedimento para todas as placas da biblioteca para seleção de hits. Avalie os valores de conteúdo de DNA utilizando estatística de escore Z.Observe que o escore Z não é o mesmo que o fator Z. Fornece uma medida estatística para a significância do valor da amostra em comparação com um controle negativo ou controle simulado. É calculado segundo a equação mostrada aqui.Calcule o zco para todas as amostras de RNA fáceis utilizando o sinal do controle negativo de luciferase de baunilha como referência para a seleção de hits. Um limite deve ser aplicado. Normalmente, utiliza-se um critério de significância para Z maior que dois ou menor que menos dois. No entanto, dependendo do processo biológico estudado ou do escopo da triagem, diferentes limites podem ser aplicados.Métodos de avaliação matemática mais elaborados, como o Q, também podem ser utilizados para a seleção de hits. Em seguida, os hits selecionados são submetidos a uma triagem secundária e à validação de HIIT. Uma triagem secundária dos genes HIIT selecionados sucede a triagem primária, a fim de eliminar falsos positivos decorrentes de variações experimentais.Primeiro, verifique os acertos selecionados utilizando o mesmo procedimento da triagem primária, exceto por montar os acertos com um número maior de réplicas, entre três e cinco, para permitir uma avaliação estatística mais robusta. Para os acertos confirmados, utilize o mesmo ensaio e leitura da triagem primária, mas com um RNA fácil secundário não sobreposto ou outro indutor de silenciamento não sobreposto, como um siRNA sintetizado quimicamente. Valide, por fim, os genes selecionados por meio de comparação entre espécies.O resgate por RNAi é o padrão ouro para a verificação de fenótipos de RNAi disponíveis até o momento. Em resumo, um cromossomo artificial bacteriano, abreviado como BAC, que codifica um ortólogo de uma espécie diferente do gene selecionado, é estavelmente transfetado em células. Os construtos BAC preservam o gene em seu contexto genômico e permitem uma expressão quase fisiológica.A RNAi contra o gene endógeno deixará a expressão do transgene ortólogo inalterada, o que resgata o fenótipo da RNAi. Por fim, os candidatos validados são estudados com mais detalhes para, eventualmente, obter um entendimento mecanicista. Em muitos casos, a RNAi também pode ser utilizada nesses ensaios secundários mais elaborados.Por exemplo, microscopia com lapso de tempo de fenótipos de RNAi. Aqui há um exemplo de uma triagem do ciclo celular na qual o conteúdo de DNA de células R heal foi medido após a diminuição da expressão de mais de 16.000 genes do genoma humano. Foram identificados 1.351 alvos primários necessários para a divisão celular.No segundo teste, 743 acertos foram verificados com um segundo gatilho de RNA fácil e independente, utilizando um ensaio secundário. Os knockdowns que resultaram em parada na fase G2 foram separados dos knockdowns que resultaram em parada mitótica. Finalmente, um experimento de resgate do olho com RNA entre espécies para o gene Lin 54 foi utilizado para validar seu papel na divisão celular adequada.Experimentos adicionais downstream mostraram que o esgotamento de Lin 54 alterou a expressão de muitos genes do ciclo celular. Acabamos de mostrar como configurar a transfeção de alto rendimento de RNAs Mission Easy e a análise da distribuição do ciclo celular na linhagem de células de cultura de tecido humano. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as condições de transfeção e os ensaios precisam ser otimizados separadamente para cada sistema celular e cada processo biológico.Recomenda-se o uso de sistemas automatizados de manipulação líquida, mas eles não são indispensáveis, especialmente para telas em pequena escala. A manipulação manual também é viável. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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