Ensaio de gradiente de temperatura: um método para testar a preferência de temperatura em larvas de Drosophila

- Para testar a preferência de temperatura das larvas de Drosophila, crie um gradiente de temperatura aquecendo um lado de uma placa de ensaio de alumínio e resfriando o outro. O alumínio tem alta condutividade térmica, o que significa que o calor é transferido de forma eficiente, criando um gradiente de temperatura linear estável. Depois que o sistema estiver equilibrado, registre as temperaturas na placa em zonas de temperatura do mesmo tamanho e, em seguida, carregue o centro da placa com larvas limpas.

Cubra todo o sistema para eliminar a interferência da luz brilhante e inicie o teste. As larvas se distribuem pelo gradiente, evitando zonas aversivas muito quentes ou muito frias, e se instalam em zonas de temperaturas favoráveis. Esse comportamento é chamado de termotaxia. Para avaliar a preferência de temperatura das larvas, registre o número de animais em cada zona de temperatura.

No protocolo de exemplo, veremos como configurar um gradiente de temperatura de direção única entre 18 e 28 graus Celsius e como as larvas são tratadas durante o ensaio.

- Para preparar um gradiente unidirecional, primeiro crie um ambiente úmido para o ensaio. Coloque dois blocos de alumínio conectados a banhos-maria separados em toalhas de papel molhadas a 10 centímetros de distância. Os banhos-maria precisam ser aquecidos com antecedência. Em seguida, faça 100 mililitros de agarose a 1% e adicione 25 mililitros a cada placa de ensaio em uma superfície nivelada. Depois que a agarose solidificar, esfregue suavemente a superfície com uma esponja de melamina para torná-la ligeiramente grossa.

Em seguida, para promover uma transferência de temperatura eficiente, preencha todas as lacunas entre os blocos de alumínio nas placas de ensaio com água fornecida por um borrifador. Agora, coloque as placas de ensaio nos blocos de alumínio e certifique-se de que as demarcações estejam a 2 centímetros de cada borda para corresponder exatamente às bordas dos blocos de alumínio.

Em seguida, borrife uma película de água na superfície das placas para que os géis não sequem. Em seguida, cubra o sistema com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Aguarde de 5 a 10 minutos para permitir que a temperatura se equilibre. Em seguida, verifique a temperatura da superfície na placa em pelo menos 12 locais para garantir que haja uma temperatura uniforme em todo o prato, mais ou menos 2 graus Celsius. Em seguida, recoloque a tampa da caixa até que o ensaio seja realizado.

Primeiro, remova a caixa de papelão sobre o gel e verifique rapidamente a temperatura da superfície do gel. Se a superfície estiver seca, borrife uma pequena quantidade de água na superfície. Se o gel estiver bom, coloque de 100 a 200 larvas no centro de cada placa usando um pincel pequeno. Em seguida, coloque uma tampa sobre cada placa de ensaio para prender as larvas e cubra a configuração com uma caixa de papelão para evitar a exposição à luz. O ensaio está agora em andamento.

Após 10 a 30 minutos, remova a caixa de papelão e a tampa da microplaca. Em seguida, fotografe as placas de cima para registrar a posição das larvas. Coloque a caixa acima da câmera para evitar reflexos na superfície do gel. Para limpar a placa, aspire todas as larvas onde quer que elas tenham se espalhado.

Agora, calcule a distribuição percentual de larvas em cada zona usando um software de análise de imagem. Faça linhas a cada 2 centímetros com base nas demarcações da placa de ensaio e conte o número de larvas em cada zona.

- Ao contar, ignore as larvas distribuídas em regiões a 0,5 centímetros de cada borda. A espessura do gel e as condições de temperatura não são uniformes perto da borda.