Ensaio de invasão de células tumorais: um método baseado em matriz nativa 3D in vitro para avaliar as interações epitelial-mesenquimais

- Para iniciar o ensaio, primeiro pipete uma suspensão de células de fibroblastos suplementada com ácido ascórbico em uma placa de poço e incuba. O ácido ascórbico aumenta a proliferação de fibroblastos. Também estimula a secreção de componentes nativos da MEC, incorporando assim as células em proliferação na espessa matriz extracelular.

Solte suavemente a matriz da superfície da placa e deixe-a flutuar no meio. A matriz se contrai e se torna mais espessa com mais deposição e remodelação da matriz, dando origem a um tecido semelhante à derme nativa. Espalhe a matriz em uma malha porosa. Em seguida, semeie as células epiteliais do câncer sobre a matriz e incube para que as células se estabeleçam e se fixem.

Transfira o conjunto para uma plataforma de malha pré-montada em um prato. Adicione mídia para complementar apenas a camada inferior da matriz para gerar uma interface ar-líquido para as células acima. Durante a cultura, a interface promove a proliferação e diferenciação de células tumorais. As células também secretam proteases que degradam a MEC, facilitando sua migração e invasão na matriz.

No protocolo a seguir, demonstraremos um ensaio de invasão usando células de carcinoma espinocelular cutâneo em uma matriz nativa derivada de fibroblastos estromais primários.

- Comece semeando 200.000 fibroblastos por poço em placas de 6 poços em meio de fibroblastos suplementado com ácido L-ascórbico 2-fosfato recém-preparado. Realimente as células a cada 2 a 3 dias com 2 a 5 mililitros de meio fresco. Uma espessa camada de células embutidas na matriz extracelular, visível a olho nu, se formará ao final de 6 semanas. Dependendo das células usadas, a matriz visível pode se formar mais cedo ou mais tarde e pode começar a se desprender do prato, como visto aqui.

Para liberar essa camada da placa de cultura de tecidos, raspe suavemente a circunferência da matriz com uma ponta de micropipeta de 1 mililitro e, em seguida, empurre as bordas da matriz em direção ao centro do poço. As células e a matriz nativa devem se desprender facilmente da superfície da placa e agora flutuar no meio.

Espalhe a matriz nativa na mídia para evitar que ela se dobre. Deixe a matriz nativa flutuar e remodelar por 5 dias, continuando a trocar a mídia a cada 2 a 3 dias. Devido à resistência à tração e remodelação intrínseca, a matriz se contrairá drasticamente e será reduzida a uma matriz nativa menor, mas mais espessa, momento em que estará pronta para ser utilizada para o ensaio de invasão.

Para o ensaio de invasão, primeiro, use uma pinça romba para transferir a matriz nativa suavemente para uma rede de náilon. Uma vez na rede, use uma ponta de micropipeta de 1 mililitro e uma pinça romba para espalhar suavemente a matriz e ficar o mais plana possível. Em seguida, espalhe uma pequena quantidade de vaselina em uma extremidade de um cilindro clonal estéril por matriz. Em seguida, coloque os cilindros nas matrizes nativas, com o lado da vaselina voltado para baixo, para garantir uma vedação firme entre a matriz nativa e os anéis clonais.

Agora, adicione 250.000 células de carcinoma cutâneo de células escamosas, ou SCC, em meios de crescimento de queratinócitos aos cilindros. Depois que as células cutâneas do CCS se estabelecerem na matriz nativa, remova os cilindros. Em seguida, levante a rede de náilon, a matriz nativa e as células SCC cutâneas para a interface ar-líquido e em um suporte de malha de arame de aço inoxidável dobrado.

Por fim, adicionar meio de crescimento de queratinócitos suplementado com ácido ascórbico até que o nível do meio toque o fundo da matriz nativa, trocando o meio a cada 2 a 3 dias e colhendo aos 7 e 14 dias após a semeadura das células cutâneas do CCS.

• Invasion Protocol – A method used to study tumor cell invasion in a laboratory setting.
• Tumor Cell Invasion – The process by which cancer cells migrate from the primary site and invade surrounding tissues.
• Primary Tumor Cell Culture Protocol – An established method for growing primary tumor cells in vitro.
• Cell Invasion Assay – Laboratory test designed to quantify the invasion capabilities of cancer cells.
• Extracellular Matrix (ECM) – A network of non-cellular components present within all tissues and organs.

• Introduce Invasion Protocol – A laboratory method investigating tumor cell behaviors (e.g., invasion protocol).
• Key Concepts – Review components of cell invasion, such as tumor cells and ECM (e.g., ECM).
• Underlying Mechanisms – Discuss how tumor invasion occurs in the broader context of cell biology.
• Connect to Experiment – Tie the theory to cancer invasion assays and our protocol.

• What is the Invasion Protocol and how to carry out a Tumor Cell Invasion assay?
• How is a Primary Tumor Cell Culture Protocol executed?
• What role does the Extracellular Matrix (ECM) play in Tumor Cell Invasion?

• Practical Applications – Invasion protocols aid in cancer research (e.g., Oncology).
• Industry Impact – Improve treatment strategies in healthcare (e.g., Cancer therapy).
• Societal Importance – Understanding tumor invasion can help address the global cancer burden.
• Link to Scientific Advancements – Ongoing research enhances our grasp of tumor cell invasion and treatment options.