Name: Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a expressar, solubilizar e purificar a proteína de membrana MexB de Pseudomonas aeruginosa usando métodos de DNA recombinante em E. coli. Este protocolo demonstra cromatografia de afinidade e filtração em gel para obter complexos proteína-detergente puros.

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Este projeto foi suportado por concessões para CJJ da National Science Foundation e pela Sociedade de Ciências Biomolecular.

1. Dia 1: MexB de Pseudomonas aeruginosa é codificado por pFB101. O gene foi amplificado MexB de P. DNA genômico aeruginosa e inserida no NdeI e sítios de restrição XhoI do + pET30b vetor. A construção contém uma tag hexahistidine C-terminal. <ol><li> O plasmídeo é usado para transformar E. coli cepa C43 (DE3) 12, e os transformantes são semeadas em ágar LB contendo canamicina 30 ug / mL. </li></ol> 2. Dia 2: Culturas Pernoite: <ol start="2"><li> À noite, 4 X 3 culturas LB contendo 30 mL de canamicina ug / mL são inoculados das colônias transformantes fresco. Alternativamente, as culturas podem ser inoculados a partir de uma perm congelados. Estas pequenas culturas são cultivadas em um rolo a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 3. Dia 3: Growing 6 Culturas Liter: <ol start="3"><li> Na parte da manhã, use as culturas durante a noite para inocular 150 mL contendo 30 LB canamicina ug / mL. Crescer a cultura a 37 ° C em um shaker. </li><li> Na parte da tarde, use a cultura pequeno para vacinar 6 x 1L 2XYT mídia contendo 30 ug / mL de canamicina em frascos Fernbach. (Use 25 ml por cultura para uma diluição de 1:40). Crescer as culturas a 37 ° C até atingirem uma DO 600 de 0,4-0,6, cerca de 1,5 horas </li><li> Quando as culturas chegar a densidade adequada, induzir a expressão da proteína pela adição de 0,5 mL IPTG 1M. Coloque todos os frascos de volta no shaker e continuar a cultivá-las a 30 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Dia 4: A colheita de células e purificação da proteína: <ol start="6"><li> Adicionar inibidores da protease, DNAse, e lisozima às soluções de buffer da seguinte forma: a 50 mL de tampão de ressuspensão de células, adicionar 10 mg DNaseI (0,1 concentração mg / mL final), 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, e uma pitada de lisozima . A 60 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Para outro de 50 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Manter todas as três soluções no gelo. </li><li> Centrifugar as culturas 30 min 5000 rpm em grande escala de centrífuga para a colheita das células. </li><li> Ressuspender as células em 100 mL de buffer ressuspensão de células (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, 0,1 mg / mL DNAse I, pitada de lisozima) </li><li> Passe a solução da célula duas vezes através de uma célula de pressão francesa em 12.000 psi (762 pressão manométrica). Recolher o lisado celular em um frasco mantido frio no gelo. </li><li> Transferir o lisado celular para SS34 tubos de centrífuga e centrifugar para remover detritos celulares por 30 min a 10.000 rpm a 4 ° C em um rotor SS-34. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga Ti647.5. Centrifugação de 50 min a 40.000 rpm a 4C. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento, que contém as membranas celulares, em aprox. 25 mL de tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease). </li><li> Transferir a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugar a 40.000 rpm em um rotor Ti647.5 por 50 min a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet lavado membrana em 25 mL tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease). </li></ol> 5. TM Solublization Protein: <ol start="15"><li> Para as membranas ressuspenso (cerca de 25 mL), adicionar 6 mL DDM 10% (concentração final = DDM detergente 2%) Rock a mistura a 4 ° C por 2 horas. </li><li> Centrifugar a mistura a 40.000 rpm por 40 min a 4 ° C no rotor Ti647.5 para separar os complexos detergente proteína solúvel das proteínas insolúveis. Salve o sobrenadante, que contém os complexos detergente MexB proteína. </li></ol> 6. IMAC: <ol start="17"><li> Misture o sobrenadante obtido a partir da rotação de alta velocidade com os grânulos de metal talon afinidade equilibrada em tampão de ressuspensão. Incubar por 1 hora em um rolo a 4 ° C. </li><li> Despeje a pasta em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descartar a fluir. </li><li> Lavar a coluna com 20 mL (10 volumes de coluna) de tampão de Encadernação e Wash IMAC (50 Nap mM, pH 7, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% DDM) </li><li> Eluir a proteína com tampão de eluição IMAC (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM imidazol, 0,2% DDM). </li><li> Tome 15 amostras mL das frações de eluição, misture com 15 tampão de amostra 2X SDS mL para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Spin-30seg em microcentrífuga. Analisar as amostras em um 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração. </li><li> Piscina das frações contendo os complexos de proteína MexB detergente e concentrá-las em um concentrador de giro a 4 ° C. Tenha cuidado para que a proteína não precipitar nesta step. </li></ol> 7. Coluna de filtração em gel: <ol start="23"><li> Pré-equilibrar um Superose 12 HL 30/10 coluna com 24 mL de tampão execução (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% de beta-octylglucoside), e esperar por uma base plana. </li><li> Lavar a Akta circuito de carga do sistema com tampão de corrida. </li><li> Filtrar a solução de proteína usando um filtro de seringa antes de aplicá-la à coluna. </li><li> Carga de até 240 mL da solução de proteína para a coluna, com uma concentração de proteína de até 5 mg / mL. </li><li> Executar 1,5 volumes de coluna (36 mL) de tampão, coletar frações 0,25 mL. O detergente MexB complexos de proteína deve eluir como um pico em torno de 10-15 mL de volume de eluição. </li><li> Take 5 mL de amostras das frações de pico. Mix cada amostra 1:1 com tampão de amostra 2X SDS. Analisar as amostras em gel de poliacrilamida 10% para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração </li><li> Piscina as frações contendo MexB puro. </li></ol> 8. Resultados representativos: Figura 1 inclui um gel de poliacrilamida com frações obtidos a partir de coluna a coluna IMAC e frações individuais da coluna de filtração em gel. Depois que a coluna de filtração em gel a proteína aparece pura por Coomassie gel de poliacrilamida corado. Figura 2 inclui um rastreio a partir da coluna de filtração em gel mostrando o pico principal do complexo de proteínas detergente eluição da coluna. O rendimento médio de proteína MexB é de aproximadamente 2 mg por 6 litros de cultura 2XYT. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. SDS-PAGE em gel de purificação dos PDCs MexB. Lane 1, marcadores de peso molecular. 2, Pooled frações IMAC. 07/03, coluna Gel frações de filtração. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Exemplo de Resultados Gel Filtração para complexos de proteína MexB detergente (PDC).

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
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<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incluindo a fibrose cística...

<table><tbody><tr><td>Tampão amostral de SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Estirpe de E. coli C43(DE3)</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>meio 2XYT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>meio LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>comprimidos de inibidor de protease sem EDTA, Complete</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodecil-&amp;#946;-D-maltopiranosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante (See-Saw Rocker)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>resina de afinidade metálica Talon</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>géis de PAGE-SDS de poliacrilamida a 10%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>tampão de corrida Tris/glicina/SDS para PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>marcadores de peso molecular pré-coloridos Kaleidascope</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>coluna Superose 12 30/10</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>concentrador centrífugo Amicon</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>filtro de seringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>frascos Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>agitador para frascos Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema Akta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de grande escala J6 com rotor JLA-8.1000</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frascos de centrífuga de 1 l</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga RC-5</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor e tubos SS34 de ângulo fixo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrífuga de piso Sorvall</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor T647.5 e tubos com tampas</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>Célula de Pressão Francesa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão, solubilização, detergente e purificação de um transportador de membrana, as proteínas mexb resistência a múltiplas drogas

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) 1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) 11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.

Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

A multirresistência a fármacos (MDR), a capacidade de uma célula cancerígena ou patógeno de ser resistente a uma ampla gama de substâncias estrutural e funcionalmente não relacionadas...

Para purificar a proteína de membrana Mex B, primeiro a Mex B é expressa em *E. coli* utilizando métodos de DNA recombinante. Em seguida, as membranas são isoladas e as proteínas de membrana são solubilizadas com um detergente suave. A proteína de membrana solubilizada é purificada por meio de iMac e a proteína é posteriormente purificada por cromatografia de filtração em gel.O nível de purificação da proteína é determinado utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Embora este procedimento possa fornecer informações sobre transportadores transmembranares de resistência múltipla a fármacos, ele também pode ser aplicado a outras proteínas de membrana. Os procedimentos demonstrados hoje serão realizados por um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para este procedimento, Mex B de Pseudomonas aeruginosa será subclonado no vetor de expressão pET-30b(+), de modo que Mex B seja expresso com uma etiqueta de hexahistidina na extremidade C-terminal. Inicie à noite inoculando quatro culturas de 3 mililitros de LB com canamicina com transformantes frescos ou utilize um estoque congelado, cultivando as culturas em rotação a 37 graus Celsius durante a noite. Pela manhã.Utilize as culturas de crescimento prolongado para inocular 150 mililitros de LB contendo 30 microgramas por mililitro. O Mycin pode cultivar a cultura a 37 graus Celsius em agitador na parte da tarde? Utilize a cultura pequena para inocular seis vezes um litro, dois meios XYT contendo 30 microgramas por mililitro.Canamicina em frascos de cultivo com suporte para frascos? Utilize 25 mililitros por cultura para uma diluição de 1:40. Incube as culturas a 37 graus Celsius até atingirem uma densidade óptica.600 de 0,4 a 0,6, cerca de 1,5 horas. Quando as culturas atingirem a densidade adequada, induza a expressão proteica adicionando 0,5 mililitros de IPTG um molar. Coloque todos os frascos novamente no agitador e continue o crescimento a 30 graus Celsius durante a noite, até o recolhimento das bactérias na manhã seguinte.Retire os cultivos do agitador e resfrie-os. Em seguida, para colher as células, transfira os cultivos para tubos de centrífuga e centrifugue a quatro graus Celsius por 30 minutos a 5.000 rotações por minuto em uma centrífuga de grande escala, enquanto as células estão sendo centrifugadas. Suplemente 100 mililitros de tampão de re-suspensão celular com inibidores de DNAse e lisozima.Além disso, suplemente dois alíquotas do tampão de suspensão de membrana Resus com inibidores de protease conforme mostrado nesta tabela. Mantenha as três soluções em gelo após a conclusão da centrifugação. Resuspenda os pellets celulares em 100 mililitros de tampão de suspensão celular Resus.Em seguida, extraia as células. A suspensão celular é carregada na célula de pressão francesa e a célula é colocada na prensa francesa. A pressão é aplicada até atingir 12.000 libras por polegada quadrada.A válvula é aberta em uma quantidade muito pequena para que as células rompidas saiam gota a gota. É importante não abrir a válvula em excesso, permitindo que as células sejam expelidas em jato, pois serão liberadas com pressão insuficiente e não serão rompidas de forma eficiente. Colete o lisado celular em um frasco mantido frio sobre gelo.Passe a solução celular novamente por uma célula de pressão francesa a 12.000 libras por polegada quadrada. Transfira o lisado celular para tubos de centrífuga SS 34 e centrifugue para remover os detritos celulares a 10.000 rotações por minuto durante 30 minutos a quatro graus Celsius em um rotor SS 34. O próximo passo é o lisado clarificado.Utilizado para preparar a fração de membrana. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga ti. 6 4, 7 0,5, centrifugue em um rotor TI 6 4 7 0,5 a 40.000 rotações por minuto durante 50 minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante. Use uma pipeta para ressuspender suavemente o pellet, que contém as membranas celulares, em aproximadamente 25 mililitros de tampão de ressuspensão de membrana. Transfira a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugue em um rotor TI I 6 4 7 0.5 a 40.000 rotações por minuto durante 50 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, ressuspender o pellet de membrana lavado em 25 mililitros de tampão de ressuspensão de membrana. Em seguida, solubilize as proteínas de membrana nas membranas ressuspensas em cerca de 25 mililitros.Adicione seis mililitros de DDM a 10% para que a concentração final do detergente seja 2% DDM. Agite a mistura a quatro graus Celsius por duas horas. Após a incubação de duas horas na presença de DDM, centrifugue a mistura a 40.000 rotações por minuto durante 40 minutos a quatro graus Celsius no rotor TI I 6 4 7 0.5, a fim de separar os complexos solúveis de proteína-detergente das proteínas insolúveis. Guarde o sobrenadante que contém os complexos de proteína Mex B com detergente para uso na purificação. Misture o sobrenadante contendo os complexos de proteína Mex B com detergente com dois mililitros das esferas de afinidade metálica em íons equilibradas em Tampão de Suspensão Resus e incube por uma hora em um rolo rotativo a quatro graus Celsius, após a ligação das proteínas à resina.Despeje a suspensão em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descarte o fluxo inicial. Lave a coluna com 20 mililitros ou 10 volumes de coluna do tampão de ligação e lavagem iMac quando a lavagem da coluna estiver concluída. Elua as proteínas ligadas com 10 mililitros do tampão de eluição iMac.Retire amostras de 10 microlitros de cada fração de eluição. Misture com 10 microlitros de tampão amostral dois vezes concentrado de SDS e analise em um gel de poliacrilamida a 10%.Estime a quantidade e a pureza da Mex B em cada fração. Reúna as frações contendo os complexos proteicos de Mex B com detergente e concentre-as em um concentrador centrífugo a quatro graus Celsius. Tenha cuidado para que a proteína não precipite nesta etapa.Utilize várias centrifugações curtas e observe a precipitação. Após cada centrifugação, prossiga com a purificação das frações reunidas utilizando uma coluna de filtração em gel. Pré-equilibre uma coluna Super Rose 12 HL 30/10 com 24 mililitros de tampão de corrida e aguarde uma linha de base estável.Em seguida, lave o sistema de carregamento com o tampão em circulação. Antes de aplicar a proteína na coluna, filtre a solução proteica utilizando um filtro de seringa. Em seguida, carregue até 240 microlitros da solução proteica na coluna, contendo proteína com concentração de até cinco miligramas por mililitro.Execute 1,5 volumes de coluna de tampão e colete frações de 0,25 mililitro. Os complexos proteína-detergente XB eluem como um pico em torno de 10 a 15 mililitros de volume de eluição. Retire amostras de cinco microlitros das frações do pico.Misture cada amostra em proporção um para um com tampão amostral SDS duas vezes concentrado. Analise as amostras em um gel de poliacrilamida a 10% para estimar a quantidade e a pureza da me Mex B em cada fração; reúna as frações contendo ME B puro. Este gel de poliacrilamida foi carregado com frações coletadas da coluna iMac e frações individuais da coluna de filtração em gel. Após a coluna de filtração em gel, a proteína aparece pura no gel de poliacrilamida corado com kumasi.Um traço da coluna de filtração em gel mostra o pico principal do complexo proteína-detergente eluindo da coluna. O rendimento médio da proteína mxb é de aproximadamente dois miligramas por seis litros de cultura 2XYT. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em oito horas, se for executado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar, solubilizar e purificar uma proteína de membrana.

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Biologia

Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive.

In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

Uma abordagem simplificada para a triagem para a expressão de proteínas de membrana recombinantes em Escherichia coli com base na fusão de proteína fluorescente verde é apresentada.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

Os proteolipossomas são usados para estudar canais purificados e transportadores reconstituídos em um ambiente bioquímico bem definido. Um procedimento experimental para medir o efluxo mediado por essas proteínas é ilustrado. As etapas para preparar proteolipossomas, realizar os registros e analisar os dados para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da proteína reconstituída são descritas.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

Descrevemos um método para a caracterização de transportadores de membrana sufrágio movidos a prótons em preparações de vesículas de membrana produzidas pela expressão heterologous em E. coli e lise de células usando uma imprensa francesa.

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

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Este protocolo descreve um método de purificação SERCA aprimorado, que inclui o dissacarídeo trealose na etapa final de centrifugação. Este carboidrato estabiliza as proteínas em condições adversas. O SERCA purificado foi cataliticamente ativo e apresentou alta pureza, tornando-o adequado para estudos estruturais e funcionais.

Purificação do retículo sarco-endoplasmático Ca2+-ATPase do músculo de coelho

Aprenda a expressar, solubilizar e purificar a proteína de membrana MexB de Pseudomonas aeruginosa usando métodos de DNA recombinante em E. coli. Este protocolo demonstra cromatografia de afinidade e filtração em gel para obter complexos proteína-detergente puros.

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas (Vídeo) | JoVE Journal

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

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