Name: Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a expressar, solubilizar e purificar a proteína de membrana MexB de Pseudomonas aeruginosa usando métodos de DNA recombinante em E. coli. Este protocolo demonstra cromatografia de afinidade e filtração em gel para obter complexos proteína-detergente puros.

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Este projeto foi suportado por concessões para CJJ da National Science Foundation e pela Sociedade de Ciências Biomolecular.

1. Dia 1: MexB de Pseudomonas aeruginosa é codificado por pFB101. O gene foi amplificado MexB de P. DNA genômico aeruginosa e inserida no NdeI e sítios de restrição XhoI do + pET30b vetor. A construção contém uma tag hexahistidine C-terminal. <ol><li> O plasmídeo é usado para transformar E. coli cepa C43 (DE3) 12, e os transformantes são semeadas em ágar LB contendo canamicina 30 ug / mL. </li></ol> 2. Dia 2: Culturas Pernoite: <ol start="2"><li> À noite, 4 X 3 culturas LB contendo 30 mL de canamicina ug / mL são inoculados das colônias transformantes fresco. Alternativamente, as culturas podem ser inoculados a partir de uma perm congelados. Estas pequenas culturas são cultivadas em um rolo a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 3. Dia 3: Growing 6 Culturas Liter: <ol start="3"><li> Na parte da manhã, use as culturas durante a noite para inocular 150 mL contendo 30 LB canamicina ug / mL. Crescer a cultura a 37 ° C em um shaker. </li><li> Na parte da tarde, use a cultura pequeno para vacinar 6 x 1L 2XYT mídia contendo 30 ug / mL de canamicina em frascos Fernbach. (Use 25 ml por cultura para uma diluição de 1:40). Crescer as culturas a 37 ° C até atingirem uma DO 600 de 0,4-0,6, cerca de 1,5 horas </li><li> Quando as culturas chegar a densidade adequada, induzir a expressão da proteína pela adição de 0,5 mL IPTG 1M. Coloque todos os frascos de volta no shaker e continuar a cultivá-las a 30 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Dia 4: A colheita de células e purificação da proteína: <ol start="6"><li> Adicionar inibidores da protease, DNAse, e lisozima às soluções de buffer da seguinte forma: a 50 mL de tampão de ressuspensão de células, adicionar 10 mg DNaseI (0,1 concentração mg / mL final), 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, e uma pitada de lisozima . A 60 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Para outro de 50 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Manter todas as três soluções no gelo. </li><li> Centrifugar as culturas 30 min 5000 rpm em grande escala de centrífuga para a colheita das células. </li><li> Ressuspender as células em 100 mL de buffer ressuspensão de células (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, 0,1 mg / mL DNAse I, pitada de lisozima) </li><li> Passe a solução da célula duas vezes através de uma célula de pressão francesa em 12.000 psi (762 pressão manométrica). Recolher o lisado celular em um frasco mantido frio no gelo. </li><li> Transferir o lisado celular para SS34 tubos de centrífuga e centrifugar para remover detritos celulares por 30 min a 10.000 rpm a 4 ° C em um rotor SS-34. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga Ti647.5. Centrifugação de 50 min a 40.000 rpm a 4C. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento, que contém as membranas celulares, em aprox. 25 mL de tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease). </li><li> Transferir a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugar a 40.000 rpm em um rotor Ti647.5 por 50 min a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet lavado membrana em 25 mL tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease). </li></ol> 5. TM Solublization Protein: <ol start="15"><li> Para as membranas ressuspenso (cerca de 25 mL), adicionar 6 mL DDM 10% (concentração final = DDM detergente 2%) Rock a mistura a 4 ° C por 2 horas. </li><li> Centrifugar a mistura a 40.000 rpm por 40 min a 4 ° C no rotor Ti647.5 para separar os complexos detergente proteína solúvel das proteínas insolúveis. Salve o sobrenadante, que contém os complexos detergente MexB proteína. </li></ol> 6. IMAC: <ol start="17"><li> Misture o sobrenadante obtido a partir da rotação de alta velocidade com os grânulos de metal talon afinidade equilibrada em tampão de ressuspensão. Incubar por 1 hora em um rolo a 4 ° C. </li><li> Despeje a pasta em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descartar a fluir. </li><li> Lavar a coluna com 20 mL (10 volumes de coluna) de tampão de Encadernação e Wash IMAC (50 Nap mM, pH 7, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% DDM) </li><li> Eluir a proteína com tampão de eluição IMAC (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM imidazol, 0,2% DDM). </li><li> Tome 15 amostras mL das frações de eluição, misture com 15 tampão de amostra 2X SDS mL para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Spin-30seg em microcentrífuga. Analisar as amostras em um 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração. </li><li> Piscina das frações contendo os complexos de proteína MexB detergente e concentrá-las em um concentrador de giro a 4 ° C. Tenha cuidado para que a proteína não precipitar nesta step. </li></ol> 7. Coluna de filtração em gel: <ol start="23"><li> Pré-equilibrar um Superose 12 HL 30/10 coluna com 24 mL de tampão execução (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% de beta-octylglucoside), e esperar por uma base plana. </li><li> Lavar a Akta circuito de carga do sistema com tampão de corrida. </li><li> Filtrar a solução de proteína usando um filtro de seringa antes de aplicá-la à coluna. </li><li> Carga de até 240 mL da solução de proteína para a coluna, com uma concentração de proteína de até 5 mg / mL. </li><li> Executar 1,5 volumes de coluna (36 mL) de tampão, coletar frações 0,25 mL. O detergente MexB complexos de proteína deve eluir como um pico em torno de 10-15 mL de volume de eluição. </li><li> Take 5 mL de amostras das frações de pico. Mix cada amostra 1:1 com tampão de amostra 2X SDS. Analisar as amostras em gel de poliacrilamida 10% para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração </li><li> Piscina as frações contendo MexB puro. </li></ol> 8. Resultados representativos: Figura 1 inclui um gel de poliacrilamida com frações obtidos a partir de coluna a coluna IMAC e frações individuais da coluna de filtração em gel. Depois que a coluna de filtração em gel a proteína aparece pura por Coomassie gel de poliacrilamida corado. Figura 2 inclui um rastreio a partir da coluna de filtração em gel mostrando o pico principal do complexo de proteínas detergente eluição da coluna. O rendimento médio de proteína MexB é de aproximadamente 2 mg por 6 litros de cultura 2XYT. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. SDS-PAGE em gel de purificação dos PDCs MexB. Lane 1, marcadores de peso molecular. 2, Pooled frações IMAC. 07/03, coluna Gel frações de filtração. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Exemplo de Resultados Gel Filtração para complexos de proteína MexB detergente (PDC).

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
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<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incluindo a fibrose cística...

<table><tbody><tr><td>Tampão amostral de SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Estirpe de E. coli C43(DE3)</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>meio 2XYT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>meio LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>comprimidos de inibidor de protease sem EDTA, Complete</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodecil-&amp;#946;-D-maltopiranosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante (See-Saw Rocker)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>resina de afinidade metálica Talon</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>géis de PAGE-SDS de poliacrilamida a 10%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>tampão de corrida Tris/glicina/SDS para PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>marcadores de peso molecular pré-coloridos Kaleidascope</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>coluna Superose 12 30/10</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>concentrador centrífugo Amicon</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>filtro de seringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>frascos Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>agitador para frascos Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema Akta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de grande escala J6 com rotor JLA-8.1000</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frascos de centrífuga de 1 l</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga RC-5</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor e tubos SS34 de ângulo fixo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrífuga de piso Sorvall</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor T647.5 e tubos com tampas</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>Célula de Pressão Francesa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

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Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) 1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) 11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.

Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

A multirresistência a fármacos (MDR), a capacidade de uma célula cancerígena ou patógeno de ser resistente a uma ampla gama de substâncias estrutural e funcionalmente não relacionadas...

Para purificar a proteína de membrana Mex B, primeiro a Mex B é expressa em *E. coli* utilizando métodos de DNA recombinante. Em seguida, as membranas são isoladas e as proteínas de membrana são solubilizadas com um detergente suave. A proteína de membrana solubilizada é purificada por meio de iMac e a proteína é posteriormente purificada por cromatografia de filtração em gel.O nível de purificação da proteína é determinado utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Embora este procedimento possa fornecer informações sobre transportadores transmembranares de resistência múltipla a fármacos, ele também pode ser aplicado a outras proteínas de membrana. Os procedimentos demonstrados hoje serão realizados por um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para este procedimento, Mex B de Pseudomonas aeruginosa será subclonado no vetor de expressão pET-30b(+), de modo que Mex B seja expresso com uma etiqueta de hexahistidina na extremidade C-terminal. Inicie à noite inoculando quatro culturas de 3 mililitros de LB com canamicina com transformantes frescos ou utilize um estoque congelado, cultivando as culturas em rotação a 37 graus Celsius durante a noite. Pela manhã.Utili

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Biologia

Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive.

In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

Uma abordagem simplificada para a triagem para a expressão de proteínas de membrana recombinantes em Escherichia coli com base na fusão de proteína fluorescente verde é apresentada.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

Os proteolipossomas são usados para estudar canais purificados e transportadores reconstituídos em um ambiente bioquímico bem definido. Um procedimento experimental para medir o efluxo mediado por essas proteínas é ilustrado. As etapas para preparar proteolipossomas, realizar os registros e analisar os dados para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da proteína reconstituída são descritas.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

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Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

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Aprenda a expressar, solubilizar e purificar a proteína de membrana MexB de Pseudomonas aeruginosa usando métodos de DNA recombinante em E. coli. Este protocolo demonstra cromatografia de afinidade e filtração em gel para obter complexos proteína-detergente puros.

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas (Vídeo) | JoVE Journal

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

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