Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

Para purificar a proteína de membrana Mex B, Mex B é primeiro expresso em e coli usando métodos de DNA recombinante. Em seguida, as membranas são isoladas e as proteínas da membrana são solubilizadas com um detergente neutro. A proteína de membrana solubilizada é purificada por meio de iMac e a proteína é purificada por cromatografia de filtração em gel.

O nível de purificação da proteína é determinado usando eletroforese em gel de poli ACRILAMIDA SDS. Embora este procedimento possa fornecer informações sobre transportadores transmembrana de resistência a múltiplas drogas, ele também pode ser aplicado a outras proteínas de membrana, demonstrando que os procedimentos de hoje serão formados por um estudante de pós-graduação do meu laboratório Para este procedimento, Mex B de pseudomonas Aosa será subclonado no vetor de expressão PET 30 B plus para que Mex B seja expresso com uma etiqueta de histamina HEXA terminal C. Comece à noite inoculando quatro culturas de micina de lata de três mililitros de libras com transformadores frescos ou use um caldo congelado, cultive as culturas em um rolo a 37 graus Celsius durante a noite pela manhã.

Use as culturas noturnas para inocular 150 mililitros de LB contendo 30 microgramas por mililitro. A micina pode cultivar a cultura a 37 graus Celsius em uma coqueteleira à tarde? Use a cultura pequena para inocular seis vezes um litro, dois meios XYT contendo 30 microgramas por mililitro.

A micina pode em frascos de samambaia de volta? Use 25 mililitros por cultura para uma diluição de um a 40. Cultive as culturas a 37 graus Celsius até atingirem uma densidade óptica.

600 de 0,4 a 0,6, cerca de 1,5 horas. Quando as culturas atingirem a densidade adequada, induza a expressão da proteína adicionando 0,5 mililitros de um molar. IPTG. Coloque todos os frascos de volta no shaker e continue a cultivá-los a 30 graus Celsius durante a noite até colher as bactérias na manhã seguinte.

Recupere as culturas da coqueteleira e resfrie-as. Em seguida, para colher as células, transfira as culturas para tubos de centrífuga e centrifugue a quatro graus Celsius por 30 minutos a 5.000 rotações por minuto em uma centrífuga em grande escala enquanto as células estão centrifugando. Suplemente 100 mililitros de tampão de ressuspensão celular com DNAs, inibidores de protease e lisozima.

Complemente também duas alíquotas de tampão de suspensão de membrana Resus com inibidores de protease, conforme mostrado nesta tabela. Mantenha todas as três soluções no gelo quando a centrifugação estiver completa. Resus gasta os pellets de células em 100 mililitros de buffer de suspensão de resus celular.

Em seguida, extraia as células. A suspensão da célula é carregada na célula de pressão francesa e a célula é colocada na prensa francesa. A pressão é aplicada até atingir 12.000 libras por polegada quadrada.

A válvula é aberta uma quantidade muito pequena para que as células quebradas escorram. É importante não abrir muito a válvula e deixar as células jorrarem porque elas serão liberadas com pouca pressão e não serão quebradas com eficiência. Colete o lisado celular em uma garrafa, mantida fria no gelo.

Passe a solução celular por uma célula de pressão francesa novamente a 12.000 libras por polegada quadrada. Transfira o lisado celular para tubos de centrífuga SS 34 e centrifugue para remover os detritos celulares a 10.000 rotações por minuto por 30 minutos a quatro graus Celsius em um rotor SS 34. O lisado clarificado é o próximo.

Usado para preparar a fração de membrana. Transfira cuidadosamente o supinato para ti. 6 4, 7 0,5 tubos de ultra centrífuga, centrifugue em um rotor TI 6 4 7 0,5 a 40.000 rotações por minuto por 50 minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o supinado. Use uma pipeta para ressuspender suavemente o pellet, que contém as membranas celulares em aproximadamente 25 mililitros de tampão de suspensão Resus de membrana transfira a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrífuga ganhe em um rotor TI I 6 4 7 0,5 de 40.000 rotações por minuto por 50 minutos de quatro graus Celsius e ressuspenda a paleta de membrana lavada em 25 mililitros de tampão de suspensão Resus de membrana. Em seguida, solubilize as proteínas da membrana para as membranas ressuspensas a cerca de 25 mililitros.

Adicione seis mililitros de 10% DDM para que a concentração final de detergente seja de 2% DDM agite a mistura a quatro graus Celsius por duas horas após a incubação de duas horas na presença de centrífuga DDM, a mistura a 40.000 rotações por minuto por 40 minutos a quatro graus Celsius no rotor TI I 6 4 7 0,5. A fim de separar os complexos de detergentes de proteínas solúveis das proteínas insolúveis. Guarde o natante supino que contém os complexos de detergente de proteína Mex B para usar na mistura de purificação o natante supino contendo os complexos de detergente de proteína Mex B com dois mililitros de grânulos de afinidade de metal lon equilibrados em tampão de suspensão Resus incube por uma hora em um rolo a quatro graus Celsius após a ligação das proteínas à resina.

Despeje a pasta em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descarte o fluxo. Lave a coluna com 20 mililitros ou 10 volumes de coluna de encadernação do iMac e tampão de lavagem quando a lavagem da coluna estiver concluída. Eluir as proteínas ligadas com 10 mililitros de tampão de eluição iMac.

Colher amostras de 10 microlitros de cada fração de eluição. Misture com 10 microlitros de duas vezes a amostra SDS, tampão e analise em uma poliacrilamida a 10%. Gel SDS.

Estime a quantidade e a pureza do mex B em cada fração. Puxe as frações que contêm os complexos detergentes de proteína Mex B e concentre-as em um concentrador de rotação a quatro graus Celsius. Tenha cuidado para que a proteína não precipite nesta etapa.

Use vários giros curtos e observe a precipitação. Após cada centrifugação, proceda à purificação das frações agrupadas utilizando uma coluna de filtração de gel. Pré-equilibre uma super rosa 12 HL 30 sobre 10 coluna com 24 mililitros de buffer de corrida e aguarde uma linha de base plana.

Em seguida, enxágue o loop de carregamento do sistema do ator com o buffer em execução. Antes de aplicar a proteína na coluna, filtre a solução proteica usando um filtro de seringa. Em seguida, carregue até 240 microlitros da solução de proteína na coluna com uma proteína de até cinco miligramas por mililitro.

Execute volumes de 1,5 coluna de buffer e colete frações de 0,25 mililitro. Os complexos de detergentes proteicos XB eluem como um pico em torno de 10 a 15 mililitros de volume de eluição. Colher amostras de cinco microlitros das fracções de pico.

Misture cada amostra uma a uma com duas vezes o tampão de amostra SDS. Analise as amostras em um gel de poliacrilamida a 10% para estimar a quantidade e a pureza de me Mex B em cada fração, puxe as frações contendo ME B. Este gel de poliacrilamida foi carregado com frações puxadas da coluna iMac e frações individuais da coluna de filtração de gel. Após a coluna de filtração do gel, a proteína aparece pura no gel de poliacrilamida corado com kumasi.

Um traço da coluna de filtração de gel mostra o pico principal do complexo de detergente proteico eluindo da coluna. O rendimento médio da proteína mxb é de aproximadamente dois miligramas por seis litros de duas culturas XYT Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em oito horas se for realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar, solubilizar e purificar uma proteína de membrana.