Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

O objetivo geral deste procedimento é acoplar a amostragem baseada em fita adesiva de produtos frescos com a detecção molecular de células inteiras de espécies de salmonela usando fluorescência rápida em hibridização C dois, também conhecida como peixe. Isso é feito aplicando primeiro fita adesiva no material desejado e extraindo as células ligadas à superfície. As fitas de carga celular podem ser analisadas diretamente ou submetidas a enriquecimentos em fase sólida ou líquida.

A segunda etapa do procedimento é em fita, auto-fixação e desidratação em uma série de etanol para células aludidas ou enriquecidas em caldo. A segunda etapa envolve a fixação celular em suspensão, seguida pela suspensão Resus das células em tampão de armazenamento. A terceira etapa do procedimento é realizar uma etapa rápida de hibridização em fita usando um coquetel de sonda de oligonucleotídeo específico para salmonela, seguida pela remoção do excesso de sonda com um enxágue tampão de lavagem para amostras analisadas via fax, a etapa de peixe é realizada em suspensão e o excesso de sonda pode ser removido usando uma etapa de diluição simples antes da análise.

A etapa final do procedimento é contracorar as células hibridizadas ligadas à fita com DPI e examiná-las usando microscopia de fluorescência. Para análises baseadas em fatos, não é necessária uma contracoloração. Em última análise, este método fornece um meio para a detecção visual ou citométrica de espécies de salmonelas que podem estar presentes em produtos frescos amostrados.

Tive a ideia desse método pela primeira vez ao ler sobre um grupo italiano que estava usando uma abordagem semelhante para examinar comunidades bacterianas em relíquias de pedra aeronáutica romana. Mas r e eu lideramos uma discussão sobre esse trabalho em uma aula que eu estava ensinando sobre métodos rápidos em microbiologia de alimentos. Algumas semanas depois, um surto de salmonela atribuído a produtos frescos começou a adoecer quase 1500 pessoas em 43 estados diferentes.

Embora nossa abordagem experimental ofereça um caminho oportuno e prático para a detecção de tipos bacterianos específicos em produtos frescos, ela também é portátil o suficiente para permitir testes em campo ou em um ambiente de produção de alimentos. Comece selecionando uma fita para usar na amostragem. Algumas opções incluem a fita de fungos disponível comercialmente ou contatada, que são estéreis e também embaladas para facilitar o uso.

Com um marcador permanente, desenhe quadrados de um centímetro no lado não doente de um pedaço de fita adesiva de 10 centímetros usando um molde de alumínio estéril. Isso servirá como um guia visual para observar qual parte da fita foi usada para amostrar a superfície alimentar ou ambiental de formar um laço de fita em forma de CS com o lado adesivo voltado para a superfície a ser amostrada. Para fazer isso, segure as pontas adesivas com o polegar e o dedo médio e posicione o dedo indicador contra o quadrado desenhado na parte de trás da fita.

Coloque a fita na superfície a ser amostrada e pressione suavemente a área marcada contra a superfície sem soltar as bordas da fita. Use o dedo indicador para garantir que o lado adesivo da fita entre em contato total com a superfície da amostra. Evitando bolhas usando um movimento uniforme.

Puxe lentamente a fita para longe da amostra. Micróbios ligados à superfície que extraem fisicamente prendem a carga celular. Cole o lado adesivo para cima em uma lâmina de microscópio de vidro Usando fita de escritório transparente genérica, garanta a tensão e o alongamento adequados da fita para que uma superfície plana e não enrugada seja criada.

Isso ajudará a minimizar problemas de deformação ou ondulação da fita. Durante o aquecimento subsequente. Durante a hibridização, coloque a fita voltada para baixo no tercil de corte de xilose quatro ou XLT quatro placas agri para que as células amostradas fiquem em contato direto com a superfície agri para facilitar a remoção fácil da fita da superfície agri.

Após o enriquecimento, a parte de contato da amostra moldada da fita é colocada nivelada com a superfície agrícola e uma extremidade da fita é aderida frouxamente. A parede lateral das placas de placa de Petri é invertida para evitar condensação e incubada a 35 graus Celsius. Para permitir o crescimento suficiente das espécies de salmonelas, a duração do período de incubação necessário para enriquecer as células a um nível detectável dependerá dos níveis iniciais de contaminação por salmonelas.

Após o período de enriquecimento desejado, abra a placa de ágar, a fita manterá sua aderência durante a incubação. Pressione suavemente a fita contra o ágar usando o dedo indicador para garantir a recuperação máxima das microcolônias formadas Na interface do ágar fita, segure a fita pela borda presa à parede da placa de Petri e remova-a com um movimento lento e uniforme. Usando fita de escritório transparente genérica, monte a fita de carga de célula com o lado adesivo para cima em uma lâmina de microscópio para que uma superfície plana e não enrugada seja criada.

Execute a fixação da célula em fita por 30 minutos a 25 graus Celsius, cobrindo a área de contato da amostra com 500 microlitros de formina tamponada a 10% neutra. Descarte o fixador em um recipiente lacrado sob uma capa química para minimizar a exposição a vapores irritantes ou tóxicos, lave a fita uma vez em uma solução salina tamponada com fosfato ou PBS inundando suavemente a superfície da fita com PBS para desidratar a amostra. Usando uma série progressiva de etanol, prepare tampões de hibridização e lavagem de pré-hibridização usando o filtro comercial de soluções de grau de biologia molecular usando uma seringa de ponta de 22 micrômetros e pré-aqueça a hibridização e os tampões de lavagem a 55 graus Celsius.

Adicione sondas de oligonucleotídeos marcadas com fluorescência ao tampão de hibridização pré-aquecido para uma concentração final da sonda de cinco nanogramas por microlitro sobreponha a área de contato da amostra moldada da fita com 300 microlitros de tampão de hibridização contendo o coquetel da sonda e as células ligadas à fita hibridizada em uma câmara de incubação selada úmida ajustada a 55 graus Celsius para uma incubadora de contato direto, como o instrumento de modo slide hibridizado por 15 minutos. Após a hibridização, as lâminas são removidas e a sonda que contém a sobreposição do buffer de hibridização é descartada. Enxágue breve e suavemente com tampão de lavagem pré-aquecido por pipetagem.

Um pequeno volume de tampão sobre uma lâmina inclinada permite que as lâminas sequem ao ar para detecção de espécies de salmonela por meio de microscopia de fluorescência. Sobreponha a lâmina com cerca de 10 microlitros de escudo vetorial H 1200, meio de montagem contendo dpi, a mancha do contador nuclear incuba no escuro por 10 minutos. Coloque óleo de imersão na tampa, deslize e examine as amostras usando uma objetiva de óleo de alta ampliação.

O filtro DPI é usado para colocar a amostra em foco. O microscópio é então comutado para o filtro apropriado e as células de salmonela são pontuadas visualmente de acordo com sua fluorescência verde ou vermelha, dependendo de qual corante é usado para rotular as sondas. A detecção cítrica anterior transfere amostras suspensas de PBS para tubos de amostragem de fundo redondo de cinco mililitros e examina usando um citômetro de fluxo com excitação a 647 nanômetros.

Analise os dados usando o software FlowJo. A amostragem de fita adesiva de sorovar terica, Ty Murium, da superfície de um tomate contaminado artificialmente, facilita a análise direta pós-peixe por meio de microscopia ou carga celular de citometria de fluxo. As fitas foram processadas para fluorescência rápida em hibridização C dois usando uma combinação de sondas de DNA específicas para salmonela e marcadas com Texas Red, dependendo da concentração local inicial de células de salmonela na fita.

O enriquecimento em fase sólida produziu resultados que variaram de microcolônias isoladas a crescimento confluente. As células amostradas com fita podem ser analisadas por meio de citometria combinada de peixes e fluxo, imediatamente após a amostragem ou após uma superfície líquida de cinco horas. Mini enriquecimento de cultura a 35 graus Celsius.

Embora tenhamos descrito o uso da técnica de peixe de fita para segurança alimentar, o método também tem um bom potencial para uso em outras disciplinas, incluindo microbiologia ambiental, patologia vegetal ou microbiologia clínica. Paralelamente a este procedimento, experimentos adicionais, como testes bioquímicos ou PCR, podem ser realizados em enriquecimentos em fase sólida ou líquida a partir de amostras extraídas com fita. Os testes podem ser usados para responder a perguntas sobre uma salmonela que possa estar presente, perguntas que estão além do escopo do procedimento de pesca.