Separação baseada em cromatografia em camada fina de nucleotídeos (p)ppGpp isolados de bactérias induzidas por estresse
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:43 min. • September 26th, 2025
Comece com extratos de nucleotídeos radiomarcados obtidos de uma cultura bacteriana antes e depois da indução de estresse.
Sob estresse, as enzimas bacterianas convertem trifosfato de guanosina e difosfato de guanosina em nucleotídeos induzidos por estresse pentafosfato de guanosina e tetrafosfato de guanosina.
Colocar os extractos numa placa de cromatografia de camada fina pré-revestida com um polímero catiónico como fase estacionária.
Coloque a placa em uma câmara contendo um tampão como fase móvel, garantindo que o líquido permaneça abaixo do local para evitar a difusão precoce.
Permita que o tampão suba por ação capilar, separando os nucleotídeos carregados negativamente em bandas distintas com base em sua carga e tamanho.
Após o desenvolvimento, remova a placa, seque ao ar e apare a parte superior para eliminar os isótopos livres e reduzir o sinal de fundo.
Exponha a placa a uma tela sensível à radiação para detectar o sinal radioativo.
Níveis aumentados de tetrafosfato de guanosina e pentafosfato de guanosina após indução de estresse revelam mudanças dinâmicas no pool de nucleotídeos de guanosina.
Primeiro, coloque uma placa de TLC de celulose PEI de 20 por 20 centímetros.
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