Separação baseada em cromatografia em camada fina de nucleotídeos (p)ppGpp isolados de bactérias induzidas por estresse

Comece com extratos de nucleotídeos radiomarcados obtidos de uma cultura bacteriana antes e depois da indução de estresse.

Sob estresse, as enzimas bacterianas convertem trifosfato de guanosina e difosfato de guanosina em nucleotídeos induzidos por estresse pentafosfato de guanosina e tetrafosfato de guanosina.

Colocar os extractos numa placa de cromatografia de camada fina pré-revestida com um polímero catiónico como fase estacionária.

Coloque a placa em uma câmara contendo um tampão como fase móvel, garantindo que o líquido permaneça abaixo do local para evitar a difusão precoce.

Permita que o tampão suba por ação capilar, separando os nucleotídeos carregados negativamente em bandas distintas com base em sua carga e tamanho.

Após o desenvolvimento, remova a placa, seque ao ar e apare a parte superior para eliminar os isótopos livres e reduzir o sinal de fundo.

Exponha a placa a uma tela sensível à radiação para detectar o sinal radioativo.

Níveis aumentados de tetrafosfato de guanosina e pentafosfato de guanosina após indução de estresse revelam mudanças dinâmicas no pool de nucleotídeos de guanosina.

Primeiro, coloque uma placa de TLC de celulose PEI de 20 por 20 centímetros.

Use uma tesoura para remover os cinco centímetros superiores e use um lápis macio para marcar uma linha de origem a um centímetro da borda. Aplique uma gota de cinco microlitros de cada amostra na superfície do PEI.

Antes que a mancha seque, transfira a placa para um tanque contendo uma camada de fosfato monopotássico 1,5 molar que seja raso o suficiente para não tocar no local da amostra de origem. Cubra o tanque com uma vedação hermética e permita a subida do líquido até o topo da folha aparada de 15 centímetros. Depois disso, remova o cromatograma totalmente desenvolvido e seque-o ao ar em temperatura ambiente.

Cortar e rejeitar a parte superior do cromatograma que contém o P32 livre em resíduos radioactivos. Use uma tela de fósforo para expor os filmes audioradiográficos durante a noite. No dia seguinte, revele o filme e use um gerador de imagens de fósforo para capturar e quantificar o sinal verde do fósforo.

Em seguida, use o software ImageJ para quantificar os pontos radioativos.