Why does transformation efficiency matter for target validation in E. coli?

High transformation efficiency ensures sufficient numbers of engineered cells for reliable protein expression, which is essential for accurate assessment of target function and pathway involvement in early discovery.

How does isolation of variables during electroporation support discovery pipeline consistency?

Controlling parameters such as voltage, pulse length, and cell preparation minimizes variability in DNA uptake, enabling reproducible strain generation across experiments and teams.

What quantitative measurements enable assessment of electroporation success in microbial systems?

Colony-forming unit counts on antibiotic-selective plates provide a direct measure of transformation efficiency, allowing teams to compare conditions and optimize protocols.

Why are replication requirements critical for cross-functional collaboration in microbial engineering?

Replication ensures that transformation results are consistent and transferable between labs, supporting reliable handoff from strain generation to expression and screening teams.

What statistical analysis capabilities are required before implementing electroporation in discovery workflows?

Teams must be able to quantify transformation efficiency, assess variance across replicates, and apply thresholds for success to ensure method reliability in strain generation pipelines.

Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

0 views • 3:33 min • October 30th, 2025

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Comece com um tubo contendo bactérias inoculadas em um meio nutriente.

Incubar com agitação até que as células atinjam a fase de divisão ativa.

Centrifugue para coletar as células e descartar o sobrenadante.

Lave repetidamente as células com glicerol gelado para remover os sais e ressuspenda em glicerol para manter a viabilidade celular.

Preparar um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos em água estéril com EDTA para evitar a degradação do ADN.

Misturar a solução plasmidial com as células bacterianas.

Aplique um pulso curto de alta voltagem para criar temporariamente poros na membrana bacteriana.

Isso permite que o DNA do plasmídeo entre no citoplasma.

Transfira imediatamente as células para um meio de recuperação e incube com agitação.

Os componentes do meio suportam o reparo da membrana e a expressão gênica de resistência a antibióticos codificada por plasmídeo.

Espalhe as células em ágar nutriente contendo o antibiótico e incube até formar colônias.

Escolha uma única colônia e coloque-a em um prato novo para purificar os transformadores.

Para iniciar o experimento, prepare células eletrocompetentes das 10 principais cepas de E. coli .

Transfira uma única colônia para um mililitro de meio LB. Incube o tubo a 37 graus Celsius enquanto agita a 180 RPM. Dilua a pré-cultura para 500 em 25 mililitros de meio LB fresco e incube a cultura a 37 graus Celsius até atingir a fase logarítmica de 0,6 OD. Centrifugue a suspensão da célula a 5.000 RPM por 20 minutos.

Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 25 mililitros de 10% do volume por volume, água gelada e estéril com glicerol, e repita esta etapa quatro vezes, tendo o volume de ressuspensão a cada vez até atingir 1,5 mililitros.

Em seguida, ressuspenda o pellet em glicerol a 10% e divida a suspensão celular em alíquotas de 50 microlitros. Armazene as alíquotas a 80 graus Celsius negativos por até seis meses. Para continuar o experimento, dissolva o plasmídeo desejado em água estéril suplementada com EDTA 0,5 milimolar e descongele uma alíquota de células eletrocompetentes no gelo.

Adicione 2,5 a 5 nanogramas de vetor e misture as células descongeladas. Dispense as células em uma cubeta de 0,1 centímetro. Aplique um pulso de 1,8 quilovolt nas células e transfira imediatamente as células eletroporadas para um mililitro de meio SOC.

Incube as células agitando por uma hora, transfira alíquotas de 100 microlitros para placas de Petri contendo ágar LB e antibiótico e incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. Purifique os transformantes listrando colônias únicas em placas de Petri.