Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

Comece com um tubo contendo bactérias inoculadas em um meio nutriente.

Incubar com agitação até que as células atinjam a fase de divisão ativa.

Centrifugue para coletar as células e descartar o sobrenadante.

Lave repetidamente as células com glicerol gelado para remover os sais e ressuspenda em glicerol para manter a viabilidade celular.

Preparar um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos em água estéril com EDTA para evitar a degradação do ADN.

Misturar a solução plasmidial com as células bacterianas.

Aplique um pulso curto de alta voltagem para criar temporariamente poros na membrana bacteriana.

Isso permite que o DNA do plasmídeo entre no citoplasma.

Transfira imediatamente as células para um meio de recuperação e incube com agitação.

Os componentes do meio suportam o reparo da membrana e a expressão gênica de resistência a antibióticos codificada por plasmídeo.

Espalhe as células em ágar nutriente contendo o antibiótico e incube até formar colônias.

Escolha uma única colônia e coloque-a em um prato novo para purificar os transformadores.

Para iniciar o experimento, prepare células eletrocompetentes das 10 principais cepas de E. coli .

Transfira uma única colônia para um mililitro de meio LB. Incube o tubo a 37 graus Celsius enquanto agita a 180 RPM. Dilua a pré-cultura para 500 em 25 mililitros de meio LB fresco e incube a cultura a 37 graus Celsius até atingir a fase logarítmica de 0,6 OD. Centrifugue a suspensão da célula a 5.000 RPM por 20 minutos.

Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 25 mililitros de 10% do volume por volume, água gelada e estéril com glicerol, e repita esta etapa quatro vezes, tendo o volume de ressuspensão a cada vez até atingir 1,5 mililitros.

Em seguida, ressuspenda o pellet em glicerol a 10% e divida a suspensão celular em alíquotas de 50 microlitros. Armazene as alíquotas a 80 graus Celsius negativos por até seis meses. Para continuar o experimento, dissolva o plasmídeo desejado em água estéril suplementada com EDTA 0,5 milimolar e descongele uma alíquota de células eletrocompetentes no gelo.

Adicione 2,5 a 5 nanogramas de vetor e misture as células descongeladas. Dispense as células em uma cubeta de 0,1 centímetro. Aplique um pulso de 1,8 quilovolt nas células e transfira imediatamente as células eletroporadas para um mililitro de meio SOC.

Incube as células agitando por uma hora, transfira alíquotas de 100 microlitros para placas de Petri contendo ágar LB e antibiótico e incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. Purifique os transformantes listrando colônias únicas em placas de Petri.