Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

Comece com um tubo contendo bactérias inoculadas em um meio nutriente.

Incubar com agitação até que as células atinjam a fase de divisão ativa.

Centrifugue para coletar as células e descartar o sobrenadante.

Lave repetidamente as células com glicerol gelado para remover os sais e ressuspenda em glicerol para manter a viabilidade celular.

Preparar um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos em água estéril com EDTA para evitar a degradação do ADN.

Misturar a solução plasmidial com as células bacterianas.

Aplique um pulso curto de alta voltagem para criar temporariamente poros na membrana bacteriana.

Isso permite que o DNA do plasmídeo entre no citoplasma.

Transfira imediatamente as células para um meio de recuperação e incube com agitação.

Os componentes do meio suportam o reparo da membrana e a expressão gênica de resistência a antibióticos codificada por plasmídeo.

Espalhe as células em ágar nutriente contendo o antibiótico e incube até formar colônias.

Escolha uma única colônia e coloque-a em um prato novo para purificar os transformadores.

Para iniciar o experimento, prepare células eletrocompetentes das 10 principais cepas de E. coli .

Transfira uma única colônia para um mil