Avaliando a frequência de mutação em bactérias usando o ensaio de beta-glicosidase

Pegue uma cultura de bactérias geneticamente modificadas.

As bactérias são induzidas a expressar uma variante mutante da DNA polimerase com atividade de revisão defeituosa, o que aumenta as chances de erro de replicação.

Esses erros podem levar a mutações espontâneas na região regulatória, que desreprimem o gene da beta-glicosidase e desencadeiam a expressão da enzima beta-glicosidase.

Colete amostras em intervalos regulares de tempo e avalie o número de gerações bacterianas em cada cultura. Centrifugar as amostras e rejeitar o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um buffer.

Adicione uma solução permeabilizante e misture para permeabilizar a membrana bacteriana.

Transfira as amostras bacterianas permeabilizadas para uma placa de vários poços.

Adicione um substrato que entra na bactéria e reage com a enzima beta-glicosidase, produzindo um produto colorido.

Meça a intensidade da cor para determinar a atividade da beta-glicosidase.

Analise a atividade da beta-glicosidase nas culturas bacterianas para determinar a frequência da mutação ao longo das gerações.

Transferir uma única colónia de E. coli TOP10 contendo os vectores pBAD-ε e pGOOD1-εD12A11 para um mililitro de meio LB tratado com antibi