Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:01 min. • November 28th, 2025
Comece com uma placa de PCR contendo uma solução desnaturalizante à base de formamida.
Adicione os amplicons de PCR diluídos derivados de uma bactéria patogênica de peixes em cada poço.
Esses amplicons contêm repetições em tandem com número variável marcado fluorescente (VNTRs), sequências curtas e repetitivas usadas como marcadores genéticos para identificação bacteriana.
Sele a placa e a centrífuga para eliminar bolhas de ar.
Aqueça a placa em um ciclador térmico para desnaturar os VNTRs de dupla fiança.
A formamida melhora a separação dos fios e inibe o recozimento.
Resfrie rapidamente a placa para estabilizar o DNA de fita simples.
Centrifuge para coletar o volume da amostra.
Remova a vedação e fixe a placa com uma estrutura.
Coloque o tubo capilar e realize a eletroforese capilar.
Durante a eletroforese, fragmentos de VNTR migram pelo capilar sob um campo elétrico e se separam pelo tamanho.
Um laser excita as etiquetas fluorescentes em cada fragmento, produzindo sinais codificados por cores.
O eletroferograma resultante mostra padrões de pico de VNTR que correspondem à bactéria patogênica.
Após a confirmação dos amplificadores de PCR, utilize novas tiras ou placas de PCR para diluir os produtos de 1 a 10 em água purificada. Vórtice e centrífuga brevemente. Enquanto trabalha em uma cabine de fumo, prepare uma mistura mestra em um tubo de centrífuga composto por formamida e solução padrão de tamanho de referência.
De acordo com o número de produtos de PCR a serem analisados, use volumes de reagentes conforme detalhado no manuscrito. Permita um volume excedente de 10%. O vórtice brevemente e distribui 9,5 microlitros em poços individuais em uma placa PCR apropriada para o sistema de eletroforese capilar disponível.
Depois, adicione 0,5 microlitros de produto de PCR diluído. Sele e centrifuge brevemente. Depois, coloque a placa contendo as amostras em um termociclador de PCR e desnature as amostras a 95 graus Celsius por três minutos antes de resfriar para 4 graus Celsius indefinidamente.
Centrifuge a 1000 g por um minuto, remova cuidadosamente a vedação e carregue a placa em um sistema de eletroforese capilar calibrado conforme as instruções do fabricante. Executar a eletroforese capilar da análise de fragmentos, usando reagentes conforme apropriado para o aparelho escolhido, e ajustar as condições de execução de acordo com a descrição no manuscrito.