Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

Olá, meu nome é Ken Paradiso. Eu trabalho para Ling Gang Wu no Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Programa Intramural de AVC, localizado no NIH no campus de Bethesda. Vou mostrar a vocês as técnicas para que o caly tenha realizado o clamping de patch de gravação pré-sináptica.

Então, para preparar o tecido cerebral, removemos o cérebro do rato. Colocamos o cérebro dentro dessa solução, que seria gelada, com baixo teor de cálcio, e estaria borbulhando com carbogênio para garantir que haja um suprimento de oxigênio para o cérebro o tempo todo. E também tem que ser gelado para minimizar o DA para minimizar a quantidade de danos.

Portanto, o cérebro estaria agora nessa solução. Nós o retiraríamos, cortaríamos adequadamente para que pudesse ser colocado no bloco, montado no bloco com correlato Sano ou cola maluca, mas encheríamos a câmara com solução gelada e com baixo teor de cálcio, borbulhá-lo, colocá-lo no vibrador e, em seguida, cortar fatias de 180 a 190 mícrons de espessura a uma frequência de lâmina de 70 hertz e uma velocidade avançada de 0,01 a 0,02 milímetros por segundo. Então isso seria de 10 a 20 mícrons por segundo.

Uma vez feita cada fatia, transferimos as fatias da solução salina gelada para esta câmara, que contém solução normal de cálcio. Esta é a mesma solução em que gravamos e está a 37 graus de temperatura fisiológica. Em seguida, colocamos as fatias aqui para recuperação.

Ele fica aqui por meia hora a uma hora antes que os experimentos de fisiologia sejam executados. Então, aqui eu tenho o cérebro e vou retirá-lo da solução. Portanto, este é um cérebro maior para fins de demonstração.

Isso é de um rato P 20. Nós vamos entregá-lo. É no tronco cerebral que estamos interessados.

Então, esta área aqui embaixo e o cálice se mantiveram está bem naquela área ali. Então, o que vamos fazer é cortar o resto do cérebro, isolar o tronco cerebral e preparar o tronco cerebral para a câmara de corte. Ok, então vamos cortar o resto do cérebro apenas isolando o tronco cerebral.

Vou entregá-lo para demonstrar onde estamos. Normalmente não faríamos dessa maneira e, novamente, podemos simplesmente nos livrar de toda essa parte. Virando-o de volta, isolamos o tronco cerebral e estamos fazendo outro corte ali mesmo.

Ok, é isso. Esse é o tronco cerebral. O cálice de held está bem ali e ali.

Este é o tronco cerebral. Novamente, vamos adiar um pouco. Vamos cortar um lado do cerebelo e isso permitirá que o tronco cerebral fique de lado assim.

Colocamos um pouco de cola acrílica Sano e, mantendo-a de lado, rapidamente a enchemos com gelo frio, solução fria com baixo teor de cálcio. Coloque a linha de oxigênio lá o mais rápido possível. Agora pegamos e trazemos para o vibrato.

Nós o trazemos rapidamente para chegar ao início do cérebro e, quando chegamos ao início do cérebro, baixamos a velocidade para 0,01 milímetros por segundo. Portanto, são 10 micros por segundo. Portanto, está se movendo a um ritmo incrivelmente lento.

A primeira porção do cérebro é a parte que tem o mtb, que é o Nilo medial do corpo trapezoidal. E essa é a parte que contém o, ok, então, uma vez que eu o tenho na pipeta de transferência, tento trazê-lo o mais próximo possível da ponta da pipeta. E há a fatia do cérebro e eu a transfiro rapidamente para esta câmara, que contém uma solução de gravação padrão que contém níveis normais de cálcio e também uma temperatura mais alta.

E isso permitirá que as fatias se recuperem após os procedimentos de fatiamento que estão prontos a partir de experimentos de fisiologia. Ok, então daqui em diante, vai ser a mesma coisa repetidamente. O equipamento a seguir é o que usarei para fazer o patch clamping.

Temos um microscópio vertical de platina fixa. O palco é fixo, como eu disse, então o microscópio se move por baixo dele de um manipulador. Usamos perucas e micro manipulador Newman para segurar o palco, o estágio principal do amplificador, usamos um amplificador de grampo de patch EPC 10 da heca.

E o que eu também deveria ter mencionado é que usamos DIC com luz infravermelha. Portanto, temos uma câmera IR aqui e, portanto, tudo o que vemos será visto na tela quando estivermos procurando por CAEs. O amplificador de patch clamp é controlado por este software, que é chamado de Pulse, que também é, que também é da Heca, e controlará o amplificador e todo o experimento de fisiologia.

Os resultados serão exibidos nesta tela. O caly held é um grande terminal pré-sináptico e, por ser grande, nos permite conectar fisicamente ao terminal. Portanto, podemos fazer gravações pré-sinápticas e isso é uma coisa única, especialmente no SNC.

Portanto, isso nos permite medir os canais de cálcio ativados pré-sinapticamente. O que mais, também podemos medir a atividade do potencial de ação se quisermos estimular o nervo que leva ao cálice. O que fazemos neste laboratório é medir um processo chamado exocitose, que é a fusão de vesículas que contêm neurotransmissor com a membrana.

Agora, nessas vesículas se fundem com a membrana no processo chamado exocitose, elas adicionam membrana ao terminal sináptico, e podemos medir isso como uma mudança na capacitância. Obteremos um aumento na capacitância à medida que a membrana for adicionada ao terminal, de modo que, portanto, os experimentos que mostrarei hoje são medições de capacitância, pré-sinapticamente quando a membrana é removida. Portanto, você não pode simplesmente continuar adicionando membrana, é claro que você precisa remover algumas.

Esse processo é chamado de endocitose ou captação da membrana. Também podemos medir isso e isso será medido como uma diminuição no nível de capacitância e mostraremos exemplos disso mais tarde. Agora, o que isso nos permite fazer é monitorar a atividade dos canais de cálcio e também monitorar algumas das proteínas envolvidas na exocitose e endocitose e estudá-las.

Podemos colocar coisas como peptídeos para bloquear proteínas envolvidas em exo ou endocitose. Também podemos usar toxinas que fazem a mesma coisa. Também podemos ajustar as quantidades de cálcio que entram no terminal, para que possamos realmente estudar o processo de exocitose, a liberação de neurotransmissores, bem como a absorção da membrana que se segue a esse evento.

Este é o tubo que contém nossa solução de gravação intracelular. Nós o preparamos com antecedência e depois o congelamos e geralmente podemos usá-lo por várias semanas a um mês antes de ter que fazer uma nova solução. Novamente, pensamos imediatamente antes de fazer nossas gravações, e você sempre terá uma certa quantidade de partículas de poeira ou outro tipo de detritos que entrarão no tubo.

Você pode fazer uma de duas coisas. Você pode retirar a solução e filtrá-la, ou pode girá-la por um ou dois minutos e depois retirar a solução, deixando uma parte inferior que teria detritos e outros materiais dentro dela. Então eu prefiro girar e farei isso agora.

Portanto, este é o tubo que contém nossa solução intracelular. Está descongelado. Vamos girá-lo por cerca de dois a três minutos em uma pequena centrífuga, e isso deve ser suficiente para tirar grandes partículas de poeira da solução.

Então agora eu apenas puxo a parte superior, a solução que acabamos de girar, tomando cuidado para não agitá-la, transferindo-a para um tubo limpo, e eu retiro cerca de 90% dela. Eu tento não fazer isso de novo, pegar aquele último pedacinho. Então vou parar por aí.

Isso eu coloco no gelo imediatamente para que fique bem frio durante o experimento. Isso é muito importante. Esta é a, esta é uma das nossas pipetas.

Usamos isso para gravações intracelulares. É vidro de sílica de furo de parede espessa, dois milímetros de diâmetro externo, 1,16 milímetros de diâmetro interno. Primeiro, o que fazemos é preencher a pipeta.

Então, aplicamos sucção, colocamos a pipeta na solução de gravação e aplicamos sucção para tentar encher a ponta da pipeta, que de outra forma não encheria de outra maneira. Depois de fazer isso, pegamos um tubo capilar e enchemos o resto do eletrodo apenas pegando a parte de trás da pipeta. Esta é uma técnica de fisiologia padrão e literalmente sacudi-la.

Você corre o risco de quebrar a ponta da pipeta, mas também terá, se não fizer isso, muitas vezes terá bolhas de ar. Ok, agora nós o colocamos em nosso porta-pipetas, que está conectado ao nosso estágio principal do amplificador da planta de patch. Há um fio de cloreto de prata lá.

O fio de cloreto de prata entra em contato com a solução intracelular, e isso nos permite medir a atividade elétrica no terminal pré-sináptico. Então, o que fazemos é encontrar a fatia que contém muitos CAEs. Queremos uma alta densidade de CAEs.

Então, estamos procurando o núcleo medial do corpo trapezoidal, que é o MNTB, e é aí que o terminal, que forma o cálice, é sustentado, ou que é o aplicativo do cálice, como é encontrado. E então o que fazemos é começar a escanear a fatia. Então, por exemplo, temos um cálice que está um pouco fundo fora da superfície e não há muito para se conectar, então continuamos examinando através de nós.

Então, este é um cálice aqui que estamos procurando. O que eu fiz são duas marcas na tela, que é para onde a pipeta vai. E você pode ver que há o pedaço de cálice que eu vou atrás da pipeta que vai descer.

Vou aplicar pressão positiva para que ela empurre o cálice e depois aliviarei a pressão positiva. O cálice vai então empurrar a pipeta e, nesse ponto, aplico uma sucção muito suave e tento sugar e empurrar a membrana ou fazer com que a membrana sele na ponta da pipeta. Tudo bem, aliviou a pressão positiva.

E agora vou aplicar sucção. Então, aqui somos profissionais, estamos aplicando um pulso de cinco milivolts ou, na verdade, um pulso de quatro milivolts. Ok, é isso. Okey.

Agora diminuímos o potencial de membrana menos 80, cancelamos o boom transitório rápido. Agora vamos para a célula inteira. Vou aplicar uma sucção suave e tentar ir para o atacado.

Esses transientes de carga indicam que ele é, que a pipeta e a célula agora são contínuas que ele tem uma gravação por atacado. Essa é outra bela foto. Então, o vermelho mais claro era o traço de capacitância, e você pode ver que há um salto repentino E então ele diminuiu.

Ok, acabei de mostrar as técnicas básicas para obter gravações de um cálice sustentado Eu mostrei como produzir as fatias que contêm o núcleo medial do corpo trapezoidal. É aí que você encontrará os cálices mantidos.

E eu mostrei a vocês as técnicas para examinar as fatias. Você vai passar por cada uma das fatias, procurando a fatia que tem o maior número de caly que estão na superfície. Em seguida, você procurará a maior membrana de caly que puder encontrar e colocará o registro de grampo nela.

E eu também mostrei as técnicas para gravação de patch clamp, e essas são técnicas padrão de gravação de patch clamp.