Visualizando o Estresse Oxidativo Induzido por Patógenos em C. elegans usando SKN-1 marcado com GFP

Comece com duas placas contendo vermes C. elegans que expressam SKN-1 com proteína fluorescente verde, um fator de transcrição localizado no citoplasma intestinal. Esses vermes também contêm grânulos de lipofuscina intestinal que apresentam autofluorescência.

Uma placa é semeada com bactérias não patogênicas como grupo controle, a outra com bactérias patogênicas como grupo de teste.

No grupo teste, o peróxido de hidrogênio produzido pelo patógeno induz estresse oxidativo, desencadeando a translocação de SKN-1 para núcleos intestinais.

No grupo controle, a maior parte do SKN-1 permanece distribuída de forma difusa no citoplasma.

Lave cada placa com um buffer e transfira os vermes para tubos.

Centrifuge para separar os vermes e remover o amortecedor.

Adicione um meio contendo azida de sódio para anestesiá-los.

Monte as minhocas em almofadas de agarose, coloque os lâmpados de cobertura e observe sob um microscópio de fluorescência. Use a autofluorescência para visualizar os limites nucleares.

Sinal forte de SKN-1 nuclear no teste, em relação ao sinal citoplasmático difuso nos controles, indica relocalização nuclear e confirma o estresse oxidativo induzido por patógenos.

Usando uma pipeta, adic