Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

O objetivo geral deste procedimento é identificar o modelo físico correto que descreve a ligação de uma macromolécula ao seu ligante e determinar os parâmetros termodinâmicos associados. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de uma solução estoque da macromolécula por meio de diálise extensiva. O ligante de interesse é então dissolvido no tampão final de diálise e as concentrações de todos os componentes são determinadas no segundo passo.

As amostras de macromolécula e ligante são cuidadosamente diluídas em uma série de concentrações diferentes. Em seguida, uma série de experimentos de calorimetria de titulação isotérmica, ou ITC, é realizada em diversas concentrações tanto do ligante quanto da proteína, a fim de gerar uma série de isotermas de ITC na etapa final do procedimento. A análise global da série de experimentos é realizada utilizando diferentes modelos físicos, e o modelo que apresenta o melhor ajuste geral é identificado como o correto.

Hoje vou mostrar um método que pode ajudar a responder perguntas biofísicas, como a forma como moléculas proteicas se ligam aos seus ligantes, e que pode fornecer medidas precisas de parâmetros de ligação, tais como entropia, entalpia e constantes de associação. Antes do início deste protocolo, purifique a proteína de interesse. A macromolécula utilizada nesta demonstração é uma imunoglicosidase N seis prima, uma subtutilase um I ou uma C seis prima um I. Para começar, prepare quatro litros de tampão de diálise e resfrie até quatro graus Celsius. Em seguida, realize a diálise de um pequeno volume de uma solução de macromolécula.

Neste caso, cinco mililitros de AAC C seis linhas primas 400 micromolares, um olho em 1,3 litros de tampão de diálise a quatro graus Celsius. Isso pode ser feito em uma câmara fria ou em uma geladeira, trocando o tampão a cada oito horas e realizando a diálise um total de três vezes. Guarde a solução final de diálise.

Filtre 750 mililitros da solução final de diálise através de um filtro de celulose de 0,45 mícron e armazene a quatro graus Celsius. Este tampão, agora denominado tampão de corrida, será usado para lavagens e como diluente. Para as amostras, lave cuidadosamente um filtro de seringa de 0,2 mícron com o tampão de corrida.

Aplicar a amostra proteica e filtrar. Coletar cuidadosamente a amostra em um tubo cônico antes de armazenar a solução proteica e determinar a concentração proteica por meio de um ensaio proteico padrão. Neste caso, a concentração proteica é medida por ABSORVÂNCIA a 280 nanômetros e a concentração enzimática é calculada.

Usando um coeficiente de extinção gerado a partir do servidor proteômico EXI, armazene a proteína de maneira a maximizar a estabilidade a longo prazo. O AAC C seis prime um olho deve ser armazenado a quatro graus Celsius, pois não retém atividade após congelamento e descongelamento. Em seguida, dissolva o ligante e o tampão de corrida. Para esta demonstração, quatro miligramas de acetil coenzima A foram dissolvidos em 200 microlitros de tampão de corrida para produzir uma solução estoque de 25 milimolares.

Este ligante pode ser armazenado a menos 78 graus Celsius até o momento de seu uso para preparar as amostras de CIT, primeiro calcule a concentração da enzima para obter um valor C de 64 conforme descrito no protocolo escrito para AAC seis primo um I. Isso corresponde a uma concentração de 192 micromolar. Prepare uma solução de dois mililitros da macromolécula nesta concentração, diluindo a solução estoque com o tampão de corrida filtrado FIA. Deixe o coenzima A descongelar em banho de gelo e água. Uma vez que a solução de acetil coenzima A esteja descongelada, misture suavemente e calcule a concentração da solução de ligante multiplicando a concentração da macromolécula pelo número de sítios de ligação multiplicado por 10.

Prepare a solução de acetil coenzima A adicionando 80 microlitros da solução estoque de 25 milimolar de acetil coenzima A a 420 microlitros de tampão de corrida e misturando. Transfira a solução diluída de acetil coenzima A para um tubo de enchimento de pipeta e devolva a solução estoque restante de 25 milimolar a menos 78 graus Celsius para armazenamento. Desgaseifique as soluções de a C seis primo um olho e de acetil coenzima A sob vácuo por cinco minutos a 19 graus Celsius, o que corresponde a um grau Celsius abaixo da temperatura de corrida experimental desejada.

Para montar a seringa de injeção, insira a seringa através do suporte da seringa até que o grampo pré-montado da seringa esteja na mesma altura do suporte. Encaixe o segundo grampo da seringa sobre a seringa de injeção até que esteja firmemente pressionado contra a base do suporte da seringa. Aperte suavemente o grampo com a chave sextavada de 0,05 polegadas fornecida.

Em seguida, coloque o suporte da seringa no suporte para pipeta. Deslize suavemente o injetor de pipeta para dentro da seringa de injeção e certifique-se de que a ponta do êmbolo seja inserida diretamente no orifício da seringa. Após inserção completa, parafuse o colar de travamento do suporte da seringa no injetor de pipeta.

Antes de carregar a solução da amostra da proteína A a C seis prime um olho, utilize o sistema de lavagem da célula fornecido com o instrumento para lavar a célula da amostra com pelo menos 50 mililitros do tampão de corrida. Remova o tampão residual da célula da amostra por aspiração com uma seringa de vidro de 2,5 mililitros com agulha longa. Remova as soluções do vácuo de desgaseificação utilizando uma segunda agulha longa limpa e seca.

Seringa de 2,5 mililitros. Aspire cuidadosamente no mínimo 1,8 mililitro da amostra da proteína A a C seis linhas primas um olho para dentro da seringa. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar.

Uma vez que a seringa esteja carregada com a amostra da proteína, insira a agulha na cubeta e toque suavemente o fundo da cubeta. Levante a agulha aproximadamente um milímetro e injete suavemente a amostra na cubeta até que o líquido em excesso fique visível acima da parte superior da cubeta. Para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas, levante a agulha cerca de um centímetro, garantindo que a solução permaneça no extravasamento, e retire e injete rapidamente cerca de 0,25 mililitros da solução.

Agora deslize suavemente a agulha para cima ao longo do lado do extravasamento. No poço da amostra, a agulha atingirá um degrau. Retire todo o líquido acima desse degrau, pois ele indica a altura desejada para a solução de corrida.

Para carregar a seringa de injeção, acople a seringa plástica de enchimento na porta de preenchimento e abaixe a extremidade do êmbolo até o topo da porta de preenchimento. Agora, posicione o tubo de enchimento da pipeta com a solução do ligante DGA na parte inferior do suporte de pipeta. Verifique se a ponta da seringa não toca o fundo do tubo de enchimento e aspire lentamente a solução para dentro da seringa até que uma pequena quantidade entre no tubo da seringa de carregamento.

Em seguida, feche o orifício de enchimento abaixando a ponta do êmbolo. Isso é feito clicando no botão de fechar orifício de enchimento. Depois, remova quaisquer bolhas de ar que possam ter ficado aprisionadas durante o carregamento.

Esvazie e reabasteça clicando no botão de esvaziamento e reabastecimento. Esvazie e reabasteça um total de três vezes. Após a conclusão do processo de esvaziamento e reabastecimento, remova o tubo de preenchimento do suporte da pipeta e limpe suavemente a ponta da seringa com papel-toalha de laboratório.

Agora, abaixe a seringa do conjunto de pipeta para dentro da amostra. Tenha cuidado e prossiga lentamente, pois a agulha pode entortar facilmente. Certifique-se de que a seringa esteja completamente inserida pressionando a base do colar travável para baixo.

Uma vez que a seringa esteja fixada, defina a temperatura de operação desejada e selecione uma potência de referência ligeiramente maior do que o fluxo de calor máximo por injeção esperado. Neste exemplo, 20 graus Celsius e 20 microcalorias por segundo são utilizados como temperatura de operação e potência de referência, respectivamente. Em seguida, programe os volumes de injeção e os atrasos desejados.

Aqui, são utilizadas 28 injeções, sendo a primeira com um volume de dois microlitros e um atraso de 62 segundos, e as injeções subsequentes com um volume de 10 microlitros e atrasos de 332 segundos. O experimento demonstrado aqui fornece a base para gerar um conjunto de dados em uma única concentração, a fim de produzir as curvas adicionais necessárias. Repita este processo com concentrações decrescentes de macromolécula e ligante.

Certifique-se de que todas as amostras de macromoléculas e ligantes provenham da mesma solução estoque para minimizar erros nas concentrações. É mostrado aqui o traçado bruto de calorimetria de titulação isotérmica obtido a partir da titulação de ligante acetil coenzima A 3,86 milimolar em 192 micromolar da micromolécula. A A C seis prime um.

Os valores integrados do olho foram utilizados para determinar os parâmetros de ligação com um ajuste sequencial de dois sítios. Este gráfico mostra as isotermas geradas por calorimetria isotérmica de titulação (ITC) com concentrações variadas de Coenzima A da ECA e AAC C seis Prime Um Olho. Os dados experimentais representados por círculos vazios foram ajustados tanto a um modelo independente de dois conjuntos de sítios quanto a um modelo sequencial de dois sítios.

Observa-se uma melhor concordância com o modelo sequencial de dois sítios. As concentrações de proteína utilizadas são definidas no texto acompanhante. Ao realizar este procedimento, é importante ser muito preciso na sua diluição, pois a alteração nas concentrações pode ter um impacto drástico nos seus resultados.