Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

O objetivo geral deste procedimento é identificar o modelo físico correto que descreve a ligação de uma macromolécula ao seu ligante e determinar os parâmetros termodinâmicos associados. Isso é conseguido preparando primeiro uma solução estoque da macromolécula por meio de diálise extensiva. O ligante de interesse é então dissolvido no tampão de diálise final e as concentrações de todos os componentes são determinadas na segunda etapa.

As amostras de macromoléculas e ligantes são cuidadosamente diluídas em uma série de concentrações diferentes. Em seguida, uma série de experimentos de calorimetria de titulação isotérmica, ou ITC, são realizados em várias concentrações de ligante e proteína para produzir uma série de isotermas ITC na etapa final do procedimento. A análise global da série de experimentos é realizada usando diferentes modelos físicos e o modelo que dá a melhor concordância geral é identificado como correto.

Hoje mostrarei um método que pode ajudar a responder a questões biofísicas, como como as moléculas de proteína se ligam a seus ligantes e podem fornecer medidas precisas de parâmetros de ligação, como entropia, entropia e constantes de associação, antes do início deste protocolo. Purifique a proteína de interesse, a macromolécula usada nesta demonstração é um imunoglicosídeo N seis primos, uma transferase sutil I ou um C seis primos um I.To começar, preparar quatro litros de tampão de diálise e esfriar a quatro graus Celsius. Em seguida, dialise um pequeno volume de uma solução de macromolécula.

Neste caso, cinco mililitros de 400 micromolares AAC C seis prime, um olho em 1,3 litros de tampão de diálise a quatro graus Celsius. Isso pode ser feito em uma câmara fria ou geladeira, trocar com tampão fresco a cada oito horas e dialisar um total de três vezes. Salve a solução final de diálise.

Filtre 750 mililitros da solução final de diálise através de um filtro de celulose de 0,45 mícron e armazene a quatro graus Celsius. Este tampão agora conhecido como tampão de corrida será usado para enxágues e como diluente. Para as amostras, enxágue bem um filtro de seringa de 0,2 mícron com tampão de corrida.

Aplique a amostra de proteína e filtre. Colete suavemente a amostra em um tubo cônico antes de armazenar a solução de proteína, determine a concentração de proteína com um ensaio de proteína padrão. Neste caso, a concentração de proteína é medida por ABSORBENCE a 280 nanômetros e a concentração da enzima é calculada.

Usando um coeficiente de extinção gerado a partir do servidor proteômico XI, armazene a proteína de maneira a maximizar a estabilidade a longo prazo. AAC C seis primos de um olho deve ser armazenado a quatro graus Celsius, pois não retém atividade após o congelamento e descongelamento em seguida, dissolveu o ligante e o tampão de funcionamento. Para esta demonstração, quatro miligramas de acetil coenzima A foram dissolvidos em 200 microlitros de tampão de corrida para fazer uma solução estoque de 25 milimolares.

Este ligante pode ser armazenado a menos 78 graus Celsius até que esteja pronto para uso para preparar as amostras ITC, primeiro, calcule a concentração da enzima para obter um valor C de 64, conforme descrito no protocolo escrito para AAC seis primos I. Isso corresponde a uma concentração de 192 micromolar. Preparar uma solução de dois mililitros da macromolécula a esta concentração, diluindo a solução de reserva com o tampão filtrado FIA decantar a coenzima um descongelamento, a acetal coenzima uma solução em banho-maria gelado. Uma vez que a coenzima acetal uma solução é descongelada, calcule suavemente a concentração da solução ligante multiplicando a concentração da macromolécula pelo número de locais de ligação multiplicado por 10.

Prepare a coenzima acetil uma solução adicionando 80 microlitros da coenzima ACE de 25 milimolares, uma solução estoque a 420 microlitros de tampão de corrida e mistura. Transfira a solução diluída de acetil coenzima ECA para um tubo de enchimento de pipeta e retorne a solução estoque de 25 milimolares restantes a menos 78 graus Celsius para armazenamento. Desgaseifica o C seis prime um olho e uma coenzima sutil, soluções A sob vácuo por cinco minutos a 19 graus Celsius, que é um grau Celsius abaixo da temperatura experimental de funcionamento desejada.

Para configurar a seringa de injeção, insira a seringa através de um suporte de seringa até que a seringa montada no prem clamp esteja na mesma altura que o suporte. Passe a segunda seringa clamp sobre a seringa de injeção até que esteja firmemente pressionada contra a parte inferior do suporte da seringa. Aperte suavemente o clamp com o acionamento hexagonal de 0.05 polegadas fornecido.

Em seguida, coloque o suporte da seringa no suporte da pipeta. Deslize suavemente o injetor de pipeta na seringa de injeção e certifique-se de que a ponta do êmbolo seja alimentada diretamente no orifício da seringa. Uma vez totalmente inserido, aparafuse o colar de travamento do suporte da seringa no injetor de pipeta.

Antes de carregar a solução de amostra de proteína ocular A a C six prime one, use o sistema de lavagem de células fornecido com o instrumento para lavar a célula de amostra com pelo menos 50 mililitros de tampão de corrida. Remover o tampão residual da célula de amostra por aspiração com uma seringa de vidro de agulha longa de 2,5 ml. Remova as soluções do vácuo de desgaseificação usando uma segunda agulha longa limpa e seca.

Seringa de 2,5 mililitros. Retire cuidadosamente um mínimo de 1,8 mililitros da amostra de proteína A a C six prime one eye para a seringa. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar.

Assim que a seringa estiver carregada com a amostra de proteína, insira a agulha na célula da amostra e toque suavemente no fundo da célula. Levante a agulha aproximadamente um milímetro e injete suavemente a amostra na célula até que o excesso de líquido seja visível acima do topo da célula da amostra. Para liberar a célula de quaisquer bolhas de ar presas, levante a agulha em cerca de um centímetro, garantindo que a solução permaneça no transbordamento e retire e injete rapidamente aproximadamente 0,25 mililitros da solução.

Agora deslize suavemente a agulha para cima ao longo da lateral do transbordamento. No poço da amostra, a agulha atingirá uma borda. Retire todo o líquido acima desta saliência, pois a saliência indica a altura desejada para a solução em execução.

Para carregar a seringa de injeção, conecte a seringa de inchaço do tubo de plástico na porta de enchimento e abaixe a ponta do êmbolo até o topo da porta de enchimento. Agora coloque o tubo de enchimento da pipeta da solução de ligante DGAs na parte inferior do porta-pipeta. Verifique se a ponta da seringa não toca no fundo do tubo de enchimento e puxe lentamente a solução para dentro da seringa até que uma pequena quantidade entre no tubo da seringa de carregamento.

Em seguida, feche a porta de enchimento abaixando a ponta do êmbolo. Isso é feito clicando no botão fechar porta de preenchimento. Em seguida, para remover quaisquer bolhas de ar que possam ter ficado presas durante o carregamento.

Limpe e reabasteça clicando no botão de recarga de limpeza. Purgue e reabasteça um total de três vezes. Quando o processo de recarga de purga estiver concluído, remova o tubo de enchimento do porta-pipetas e limpe suavemente a ponta da seringa com papel de seda de laboratório.

Agora abaixe a seringa do conjunto da pipeta na amostra. Bem, tenha cuidado e prossiga devagar, pois a agulha pode dobrar facilmente. Certifique-se de que a seringa esteja completamente inserida pressionando a base do colar de travamento.

Assim que a seringa estiver presa, defina a temperatura de funcionamento desejada e selecione uma potência de referência ligeiramente superior ao fluxo máximo de calor de injeção esperado. Neste exemplo, 20 graus Celsius e 20 microcalorias por segundo são usados como temperatura de corrida e potência de referência, respectivamente. Em seguida, programe os volumes e atrasos de injeção desejados.

Aqui, são utilizadas 28 injeções, sendo que a primeira tem um volume de dois microlitros e um atraso de 62 e as injeções subsequentes têm um volume de 10 microlitros com atrasos de 332. O experimento demonstrado aqui fornece a base para gerar um conjunto de dados em uma única concentração para gerar as curvas adicionais necessárias. Repita esse processo com concentrações decrescentes de macromoléculas e ligantes.

Certifique-se de que todas as amostras de macromoléculas e ligantes sejam originárias da mesma solução estoque para minimizar o erro nas concentrações. Aqui é mostrado o traço de calorimetria de titulação isotérmica bruto produzido a partir da titulação de 3,86 milimolares ligante acetil coenzima A em 192 micromolares da micromolécula. A A AC seis primos um.

Valores integrados ao olho foram usados para determinar os parâmetros de ligação com um ajuste sequencial de dois locais. Este gráfico mostra as isotermas geradas pelo ITC de concentrações variadas de ACE Coenzima A e AAC C seis Prime One Eye. Os dados experimentais representados por círculos abertos foram ajustados a um modelo independente de dois conjuntos de locais e a um modelo sequencial de dois locais.

Melhor concordância é vista com o modelo sequencial de dois locais. As concentrações de proteínas utilizadas são definidas no texto anexo. Ao realizar este procedimento, é importante ser muito preciso com sua diluição, pois a mudança nas concentrações pode ter um impacto drástico em seus resultados.