Name: Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a analisar GTPases pequenas em células epiteliais polarizadas usando microinjeção de plasmídeos. Este método permite visualizar alterações na localização de proteínas com mínimos efeitos secundários.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Institutes of Health (GM070736) para H. Fölsch. SF Ang foi apoiada por um * STAR A bolsa de Pós-Graduação e RS Kang foi apoiada pela Base Celular e Molecular do Programa de Treinamento de Doenças (GM8061)

1. Isolamento de DNA plasmidial <ol><li> Use uma endotoxina livre de Sigma-Aldrich maxiprep kit para preparar DNA endotoxina livre de acordo com protocolo do fabricante. Este kit funciona para nós, porque é confiável remove qualquer endotoxinas das preparações de DNA. Endotoxinas que são injetados com o DNA em núcleos de células irá levar à morte celular. </li><li> Adicionar 100 ul de fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) para o DNA isolado, vortex e centrifugação por 1 min a 13.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf. Transferir a fase superior de água em um novo tubo e adicionar 100 mL de clorofórmio / isoamylalcohol (24:1), vórtice e girar como acima. Transferir a fase superior de água contendo o DNA a um novo tubo. Este passo é necessário para remover qualquer proteína do DNA, o que impede o entupimento da agulha de microinjeção. </li><li> Precipitar o DNA pela adição de acetato de sódio (pH 6,0) para uma concentração final de 300 mM e 2 X de etanol 100% vol. Incubar a -20 ° C durante a noite. Spin-DNA por 20 min a 13.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf, lave uma vez com etanol 70%, e ressuspender em 300 endotoxina livre mL de água (Sigma-Aldrich). </li><li> Determinar a concentração de DNA. A concentração de DNA típico varia de 1 a 5 mg / mL. </li></ol> 2. Cultura de células MDCK <ol><li> Dividir células MDCK. Contagem de células e de sementes de 4 X 10 5 células para limpar filtros de 12 mm Transwell (0,4 mM tamanho dos poros, Corning Costar, 3460). Para um experimento contendo uma injeção de mock-controle e dois diferentes proteínas Rab mutante você precisa semente três filtros. </li><li> Células MDCK cultura em meio MEM com 2 mM L-glutamina 0,1 mg / ml de penicilina / estreptomicina e 7% (vol / vol) de soro fetal bovino (= media de crescimento MEM) a 37 ° CO C e 5% 2., </li><li> Mudança de mídia na câmara basolateral todos os dias. Isso ajuda o processo de polarização, porque imita a situação de células epiteliais nos animais. </li><li> 2 dias cheque pós-semeadura em um microscópio se as células estão crescendo em uma monocamada fechado. Se você não consegue detectar todos os furos na monocamada, realize sua experiência no dia 3. Se ainda há buracos, faça sua experiência no dia 4. </li></ol> 3. Procedimento microinjeção e Pós-injeção incubações <ol><li> No dia do experimento preparar 5 ml de mídia MEM crescimento mais 50 mM HEPES, em uma chapa de 60 mm x 15 para cada filtro e coloque em uma incubadora de 39 ° C. Além disso, criar um poço de uma placa de 12 bem com 1 ml meios de crescimento MEM acrescido de 50 mM HEPES e 0,1 mg / ml cicloheximida por filtro, e coloque em uma incubadora de 31 ° C. </li><li> Ligue o microscópio de microinjeção e definir sua fase aquecida a 39 ° C. Nós usamos um microscópio invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss microfilmagem, Inc.) com uma fase aquecida, objetivos 10X e 32X, e um FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Por último, abra o tanque de gás nitrogênio, que abastece a mesa de ar com nitrogênio. </li><li> Diluir DNA com água filtrada (use filtro 0,2 m) para uma concentração final de 0,2 mg / ml em um volume total de 10 - 100 ul. Posteriormente, spin DNA em microcentrífuga Eppendorf a 13.000 rpm por 30 min. Remover parte superior e coloque em um novo tubo. Essa etapa assegura que quando você carrega o seu DNA diluído na agulha microinjeção você pode exatamente carga de DNA "limpa". Seu DNA está agora pronto para microinjeção. </li><li> Prepare suas células tomando o primeiro filtro para fora de sua placa de cultura. Com uma lâmina cirúrgica (Blade Feather cirúrgica, aço inoxidável, n º 11), cortar o filtro do suporte do filtro e coloque em 5 ml, 39 ° C meios de crescimento quentes MEM acrescido de 50 mM HEPES (60 x 15 mm chapa). Pesar o filtro na placa de cultura com a lâmina cirúrgica que você usou para cortá-lo para fora. Colocá-la no tal filtro que o buraco da lâmina cirúrgica envolve o meio do filtro. Coloque sua placa de cultura para o palco aquecida do microscópio. </li><li> 2-3 mL de carga de seu DNA diluído (neste caso a codificação plasmídeos VSVGts045-GFP = controle de injeção simulada) em uma agulha microinjeção (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), torça a tampa protetora da agulha e deixá-lo cair no chão . Agora a agulha está pronto para ser parafusado em seu compartimento. Para isso, pressione a tecla menu do seu InjectMan e verifique se a válvula está desligado. Enrosque a agulha no respectivo suporte, cuidado para não estragar na agulha muito bem como isso pode levar à ruptura. Agora, pressione a tecla de menu novamente, o P aplicado c vai impedir a mídia de ser sugado para dentro da agulha durante o procedimento microinjeciton. Finalmente, toque o joystick para apagar homing armazenados. </li><li> Para diminuir a agulha para as células, use a objetiva de 10X e trazer a agulha para o feixe de luz acima do líquido. Agora concentrar-se nas células, trazer o foco para cima novamente, girando o anel de foco até 180 °, e encontrar a agulha. Posteriormente, mova lentamente a agulha em foco, em seguida, trazer de novo fora de foco (trabalhando para trazer as células para o foco de novo), derrubar agulha paracus novamente. Repita até que a agulha toca a superfície da mídia, altura em que tudo o que você vai ver é um halo. Quando você chegar a um ponto em que as células estão em foco, mas a agulha ainda é fuzzy (isto é, fora do plano focal) a mudança para o objectivo 32X e multa ajustes grossos. </li><li> Definir o z-limite tocando a membrana apical com a ponta da agulha e subtraindo cerca de 10 mM como os núcleos estão colocando cerca de 10 M abaixo da membrana apical. </li><li> Depois de definir o z-limite, encontrar a pressão de injeção direita. Iniciar a 95 PSI. Se a pressão for muito alta, suas células vão explodir. Se a sua pressão é muito baixa, você verá um ponto branco que se mantém, mas nada acontece. Com uma injeção bem sucedido, você vai ver uma mudança de fase sem alterar o tamanho da célula. Para a injeção, trazer a agulha de alguns microns fora do plano focal o mais rápido possível. Mire com a agulha acima do núcleo (ou seja, no meio de uma célula individual) e pressione o botão de injecção do seu joystick, mas não mantenha o botão pressionado. </li><li> 100-500 injetar células dentro do buraco de sua lâmina cirúrgica que se encontra em suas células. Quando você terminar, coloque as suas células com a placa de cultura e lâmina cirúrgica em uma incubadora de 39 ° C, e incubar por 2 h. Durante este tempo, VSVGts045-GFP é expressa e secretada no ER. No entanto, a 39 ° C, VSVGts045-GFP não pode dobrar corretamente e, portanto, não pode deixar o ER. Enquanto isso, a pequena GTPase de interesse irá acumular no citosol em co-injeção de experimentos. </li><li> Após 2 h, coloque o seu células em 1 ml de mídia crescimento MEM acrescido de 50 mM HEPES e 0,1 cicloheximida mg / ml em uma placa de 12 poços e incubar por 2 horas a 31 ° C. Durante este período de perseguição, VSVGts045-GFP irá dobrar corretamente, deixam o ER e é entregue à superfície da célula. </li><li> Repita os passos 3,1-3,10 para filtros dois (injetar plasmídeos codificando VSVGts045-GFP e, por exemplo V5-tagged Rab13T22N) e três (injetar plasmídeos codificando VSVGts045-GFP e, por exemplo V5-tagged Rab13Q67L). Cada injeção demora cerca de 20-60 min. No entanto, é absolutamente crucial para o tratamento de todas as maneiras o mesmo filtro em todo o incubações de temperatura e mudança de coloração da superfície até que você corrigir as células. Após a fixação, você pode executar o resto do seu protocolo de coloração para todos os filtros, ao mesmo tempo. </li></ol> 4. A coloração da superfície de Análise de imunofluorescência Note, a fim de evitar o branqueamento do sinal da GFP VSVGts045-GFP, proteger espécies de luz, cobrindo com papel alumínio durante todos os procedimentos subseqüentes. <ol><li> Se você deseja executar manchas na superfície, coloque suas células em um prato de cultura em uma placa de metal no gelo e lave as células com 1X PBS gelado 2 + (PBS [0,2 g / litro KCl, 0,2 g / litro KH 2 PO 4, 8 g / litro de NaCl e 2,17 g / litro Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] mais 0,1 g / litro CaCl 2 e 0,1 g / litro MgCl 2 x 6 H 2 O). Posteriormente, coloque 30 mL de um anticorpo que reconhece a ectodomínio de sua proteína, neste caso, o anticorpo monoclonal de camundongo TK1 (IgG 1, obtidos a partir do final de Thomas Kreis), em parafilme limpa colocada sobre a placa de metal no gelo. Coloque o filtro com suas células de cabeça para baixo sobre a queda e adicione algumas gotas de anticorpos para a parte de trás do filtro. Incubar por 1 hora no gelo. </li><li> Células colocar em uma placa de 12 poços, lave 3X com PBS gelado 2 + (ou RT quente PBS 2 + sem coloração da superfície antes), e corrigir com paraformaldeído a 3% por 15 min em temperatura ambiente. </li><li> Lave as células uma vez com PBS 2 + e deixar em PBS + 2 por 5 min. </li><li> Incubar as células no bloqueio / buffer permeabilização (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] saponina em PBS 2 +) com 10% [vol / vol] soro de cabra. Incubar 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticorpos primários para detectar a expressa Rab GTPase, neste exemplo anti-V5 (mouse anticorpo monoclonal IgG 2a, Invitrogen), 1:200 na BPB. Spin-anticorpos diluídos em uma microcentrífuga Eppendorf por 10 min a 13.000 rpm. ML lugar 30 da solução de anticorpos em parafilme limpa colocado em uma câmara úmida. Coloque as células no filtro de cabeça para baixo sobre a queda de anticorpos e incubar por 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Células lugar de volta (até o lado direito) em uma placa de 12 poços e lavar 5X mais de 30 min com BPB na RT. </li><li> Diluir apropriado anticorpos secundários, neste caso de cabra anti-IgG de rato 1 Alexa 594-rotulados (para detecção de VSVG na superfície, Invitrogen), e Cy5 marcado com anticorpos secundários para reconhecer o seu GTPase Rab, neste exemplo de cabra anti-IgG de rato 2a Cy5-rotulados (ImmunoResearch Jackson), 1:200 em BPB e girar como acima. Coloque 30 mL de solução de anticorpos em parafilme limpa em câmara úmida e células lugar na cabeça de filtro para baixo sobre a queda de anticorpos. Incubar 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Repita o passo 4.6. </li><li> Dip células em filtro de 3X em água deionizada e coloque racima do lado ight para microslides. Adicionar 10-15 mL de montagem (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] glicerol em água destilada) na parte superior das células. Lugar 18X18 milímetros tampa de vidro micro em cima e usando tecidos faciais pressione suavemente a tampa de vidro para a micro células. Seal com unha polonês. </li><li> Analisar amostras com um microscópio confocal. Usamos um Microsystem LSM 510, Carl Zeiss microfilmagem, Inc. que foi equipado com uma lente de 63X de imersão em água. </li><li> Para a preparação das figuras, ajustar e combinar imagens utilizando programas como o Adobe Photoshop e Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Resultados representante Para exemplos de como a co-expressão de GTPases pequenas interfere com a classificação VSVG gentilmente referem-se a artigos publicados para qualquer missorting apical 3, 4 ou inibição de entrega de superfície 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Na injeção simulada, ou seja, uma injeção de codificação apenas o plasmídeo VSVGts045-GFP, a proteína é entregue à superfície basolateral de bem-polarizada células MDCK, a julgar pela coloração de superfície (em vermelho, Figura 1 A). Note que nem todos os VSVGts045-GFP é entregue à membrana basolateral durante a perseguição a 31 ° C como evidenciado pelo sinal extensa intracelular para a proteína total (em verde, Figuras 1 A e B). Em células que não são bem-polarizada VSVGts045-GFP será entregue também à membrana apical (Figura 1 B). Se as amostras de seu controle parecido com o celular na Figura B 1, você não pode confiar seus dados e tem que repetir o experimento com melhor polarizado células. Barras de escala são 5 mm.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os passos mais críticos para um experimento de microinjeção de sucesso são a qualidade ea pureza do DNA e da polaridade de suas células. Sem células polarizadas, o seu controle de injeção já terá mistargeted VSVG eo experimento não pode ser usado. Se o DNA é de má qualidade, o DNA pode entupir a agulha de injeção levando a pouca ou nenhuma expressão da proteína desejada de todo. Além disso, é aconselhável a utilização de plasmídeos de expressão que são conhecidos por levar a níveis de alta expressão, como pRKV. <p c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 microscópio com estágio de aquecimento </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Ordem personalizada </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 micromanipulador FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> Ordem personalizada </td></tr><tr><td> Femtotips II (agulhas microinjeção) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader dicas </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Claro de 12 mm transwell filtro suporta </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxina livre kit maxiprep plasmídeo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analisando a função de gtpases pequenas pela microinjeção de plasmids em polarized células epiteliais

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Células epiteliais polarizar sua membrana plasmática em bioquímica e funcionalmente distintos domínios apical e basolateral onde o domínio apical enfrenta o &#39;livre&#39; e superfícies da membrana basolateral é em contato com o substrato e as células vizinhas. Ambos os domínios de membrana são separados por junções apertadas, que formam uma barreira de difusão. Apical-basolateral polarização pode ser reproduzido com sucesso na cultura quando as células epiteliais como Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), as células são semeados em altas densidades, em filtros de policarbonato e cultivados por vários dias 1 2. Estabelecimento e manutenção da polaridade celular é regulada por um conjunto de pequenas GTPases da superfamília Ras, como Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 3 4 5 6 7. Como todas as GTPases ciclo dessas proteínas entre um estado PIB-bound inativos e um estado GTP-bound ativo. Mutações específicas nas regiões de ligação de nucleotídeos interferir com esta bicicleta 8. Por exemplo, Rab13T22N está permanentemente bloqueado no PIB forma e, assim, apelidado de &quot;negativo dominante&quot;, enquanto Rab13Q67L já não pode hidrolisar GTP e é, portanto, trancado em um estado &quot;ativo dominante&quot; 7. Para analisar a sua função em células negativo dominante e dominante alelos ativos de GTPases são normalmente expressos em níveis elevados para interferir com a função das proteínas endógenas 9. Uma maneira elegante de alcançar altos níveis de superexpressão em um curto espaço de tempo é introduzir os plasmídeos que codificam as proteínas relevantes diretamente no núcleo das células cultivadas em polarizado filtro suporta o uso de técnica de microinjeção. Isso é muitas vezes combinada com a co-injeção de plasmídeos repórter que codificam os receptores da membrana plasmática que são especificamente classificadas para o domínio apical ou basolateral. A carga freqüentemente utilizado para analisar a carga de classificação para o domínio basolateral é um alelo sensível à temperatura da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína não pode dobrar corretamente a 39 ° C e por isso serão retidos no retículo endoplasmático (ER), enquanto a proteína reguladora de interesse é montado no citosol. A mudança para a 31 ° C, então, permitir VSVGts045 dobrar corretamente, deixam o ER e viajar para a membrana plasmática 11. Esta perseguição é geralmente realizado na presença de cicloheximida para prevenir a síntese de proteína ainda mais levando a resultados mais limpo. Aqui nós descrevemos em detalhe o procedimento de microinjecting plasmídeos em células polarizadas e incubações subseqüentes, incluindo mudanças de temperatura que permitem uma análise global das proteínas reguladoras envolvidas na triagem basolateral.

Este artigo detalha os procedimentos envolvidos na análise da superexpressão e GTPases pequenas células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

As células epiteliais polarizam sua membrana plasmática em domínios apical e basolateral, bioquímica e funcionalmente distintos, nos quais o domínio apical está voltado para...

Este procedimento analisa os efeitos de pequenas GTPases ACE no tráfego de membrana polarizada. Primeiro, injete simultaneamente plasmídeos de DNA que codificam a pequena GTPase ACE e as proteínas repórter nos núcleos celulares de células polarizadas. Em seguida, expresse o DNA em temperaturas que irão deter as proteínas repórter no retículo endoplasmático ou no TGN, enquanto a pequena GTPase se acumula no citosol, e prossiga com o rastreamento da proteína repórter até a superfície celular na presença de cicloheximida para impedir a síntese de novas proteínas.Por fim, marque a proteína repórter na superfície celular para análise por imunofluorescência. Os resultados obtidos com este ensaio permitem a visualização da alteração na localização superficial por meio de microscopia confocal. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transfeção, é que, durante os curtos períodos de superexpressão alcançados com microinjeção, os efeitos secundários são mínimos, permitindo-nos estudar os efeitos primários das proteínas de interesse.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de polaridade celular, como a forma pela qual a gtpase pequena regula o tráfego de membrana polarizado. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas individuais necessárias para uma microinjeção bem-sucedida são difíceis de explicar sem auxílio visual. Isole o DNA plasmidial livre de endotoxinas com o kit maxi prep livre de endotoxinas da Sigma Aldrich, conforme o protocolo do fabricante. Para este experimento, utilize três filtros transwell claros de 12 milímetros com porosidade de 0,4 micrômetro para o cultivo.As células são semeadas com quatro vezes 10 à quinta potência de células MDCK em cada filtro. Após dois dias, examine a cultura em microscópio para verificar se as células estão crescendo em uma monocamada fechada. Para microinjeção.No dia da microinjeção, prepare placas de 360 por 15 milímetros com cinco litros de meio de crescimento MM mais 15 milimolares de heis e coloque-as em uma incubadora a 39 °C. Além disso, prepare três placas de 12 poços com um mililitro de meio de crescimento MEM mais 50 milimolares de heis e 0,1 miligrama por mililitro de cicloeximida e coloque-as em uma incubadora a 31 °C. Ligue o microscópio de microinjeção, configurado com este microscópio invertido com platina aquecida, objetivas de 10 x e 32 x e um einor femto jet.Regule a platina aquecida para 39 graus Celsius. Abra também o suprimento do tanque de gás nitrogênio para a mesa pneumática. Agora, dilua o DNA com água filtrada até uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro.Em seguida, centrifugue o DNA em uma microcentrífuga einor a 13.000 RPM por 30 minutos. Remova a porção superior e coloque em um novo tubo. A seguir, prepare as células MDCK retirando o primeiro filtro do seu recipiente de cultura com a lâmina cirúrgica, recortando o filtro do suporte e colocando-o na placa preparada de 60 por 15 milímetros contendo cinco mililitros de meio de crescimento MEM aquecido a 39 graus Celsius, acrescido de 50 milimolares de heis.Para pressionar o filtro na placa de cultura, coloque a lâmina cirúrgica no centro do filtro e, em seguida, transfira a placa de cultura para a platina aquecida do microscópio. Carregue duas a três microlitros do DNA diluído em uma agulha de microinjeção. Gire a tampa protetora da agulha e deixe-a cair no chão.Para posicionar a agulha no suporte, pressione a tecla de menu da injeção e certifique-se de que a válvula está fechada. Parafuse a agulha em seu suporte. Cuidado para não apertar a agulha com muita força.Como isso pode causar ruptura, pressione a tecla de menu novamente. Assim, a pressão de compensação aplicada impedirá que o meio seja sugado para dentro da agulha durante o procedimento de microinjeção. Por fim, acione o joystick para apagar a referência armazenada e abaixar a agulha sobre as células.Use o objetivo de 10x e posicione a agulha no feixe de luz acima do líquido. Agora, foque as células. Foque novamente para cima girando a roda de foco 180 graus para cima e localize a agulha.Mova lentamente a agulha para colocá-la em foco. Em seguida, retire-a do foco novamente. Trabalhe para trazer as células novamente para o foco.Traga novamente a agulha para o foco. Repita até que a agulha toque a superfície do meio, momento em que um halo será observado. Continue até alcançar o ponto em que as células estejam em foco, mas a agulha ainda esteja desfocada, fora do plano focal.Agora mude para a objetiva de 32 x e encontre as configurações preliminares. Defina o limite Z tocando a membrana apical com a ponta da agulha e subtraindo cerca de 10 micrômetros, já que os núcleos estão localizados aproximadamente 10 micrômetros abaixo da membrana apical.Agora, retire rapidamente a agulha alguns mícrons do plano focal. Posicione a agulha acima do núcleo e pressione e solte o botão de injeção do joystick. Comece com 95 PSI para encontrar a pressão de injeção adequada.Se a pressão for muito alta, as células estouram. Se a pressão for muito baixa, um ponto branco persiste, mas nada mais acontece. Realize uma injeção bem-sucedida que envolva uma mudança de fase sem alteração no tamanho da célula.Injete de 100 a 500 células dentro do orifício da lâmina cirúrgica que está posicionado sobre as células. Em seguida, coloque as células com a placa de cultura e a lâmina cirúrgica em uma incubadora a 39 graus Celsius e incube por duas horas. Por fim, transfira as células para a placa de 12 poços preparada com um mililitro de MEM contendo 50 milimolar de 0,1 miligrama por mililitro de ciclo-heide e incube por duas horas a 31 graus Celsius.Para evitar o desbotamento do sinal de GFP expresso, proteja os espécimes da luz cobrindo-os com papel alumínio durante todos os procedimentos subsequentes de coloração de superfície. Coloque as células em uma placa de cultura sobre uma placa de metal em gelo e lave. Uma vez com PBS gelado mais mais, posicione um pedaço limpo de paraforma sobre a placa de metal em gelo e adicione gotas de 30 microlitros de um anticorpo que reconheça o domínio ecto da proteína de interesse usando uma pipeta.Agora, posicione o filtro contendo as células de cabeça para baixo sobre a gota e adicione algumas gotas de anticorpo no lado oposto do filtro. Incube por uma hora no gelo. Lave as células três vezes com PBS gelado mais mais e fixe com paraformaldeído a 3% por 15 minutos à temperatura ambiente.Prossiga com a lavagem das células uma vez com PBS mais mais e equilibre em PBS mais mais por cinco minutos. Incube agora as células no tampão bloqueador permeabilizante. Incube por uma hora à temperatura ambiente, dilua os anticorpos primários na proporção de um para 200 no BPB para detectar a RAB GTPase expressa, centrifugue por 10 minutos a 13.000 rpm, pipete 30 microlitros da solução de anticorpo sobre lâmina limpa colocada em câmara úmida.Coloque as células sobre o filtro de cabeça para baixo nas gotas de anticorpo e incube por uma hora. À temperatura ambiente, recoloque as células novamente com o lado certo para cima em uma placa de 12 poços e lave cinco vezes durante 30 minutos com BPB à temperatura ambiente após a incubação com os anticorpos secundários apropriados, incluindo uma etapa de lavagem.Mergulhe as células no filtro três vezes em água desionizada e coloque-as com o lado correto voltado para cima em lâminas microscópicas com 10 microlitros de meio de montagem. Coloque um micro-objeto de vidro de 18 por 18 milímetros em cima e, usando lenços faciais, pressione suavemente a lamínula sobre as células. Por fim, selar com esmalte no procedimento simulado de injeção contendo apenas o plasmídeo que codifica V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. A proteína é entregue à superfície basolateral de células MDCK bem polarizadas, conforme indicado pela coloração superficial vermelha em células que não estão bem polarizadas.Parte da proteína de fusão GFP será entregue à membrana apical. Se os espécimes controle apresentarem essa aparência, os dados não são confiáveis e o experimento deve ser repetido com células melhor polarizadas. Observe que nem toda a proteína de fusão expressa em GFP é entregue à membrana basolateral durante o período de marcação a 31 graus Celsius, como evidenciado pelo intenso sinal verde intracelular para a proteína total. Uma vez dominada, esta técnica deve levar aproximadamente de 10 a 12 horas após o seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de tráfego de membrana explorarem proteínas reguladoras em células epiteliais polarizadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar proteínas em células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.

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Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da...

Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

Este protocolo compara as afinidades relativas dos parceiros de ligação para GTPases da família Rho, incluindo Rac1. In vivo, as proteínas de ligação a Rac1 competem por uma única interface de ligação, cuja conformação é ditada por um nucleotídeo ligado. O nucleotídeo é importante e difícil de controlar experimentalmente, devido à alta taxa de hidrólise.

Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

Descrevemos um método para experimentos de depleção-resgate que preserva a integridade celular e a homeostase proteica. A adenofecção permite análises funcionais de proteínas dentro de processos biológicos que dependem de dinâmicas baseadas em actina finamente ajustadas, como divisão celular mitótica e miogênese, no nível de célula única.

Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate

A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.

Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Aprenda a analisar GTPases pequenas em células epiteliais polarizadas usando microinjeção de plasmídeos. Este método permite visualizar alterações na localização de proteínas com mínimos efeitos secundários.

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

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