Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Este procedimento analisa os efeitos de pequenos GTP ACEs no tráfego de membrana polarizada. Primeiro, co-injete plasmídeos de DNA que codificam o pequeno GTP ACE e as proteínas repórter em núcleos celulares de células polarizadas. Em seguida, expresse o DNA em temperaturas que prenderão as proteínas repórter no retículo endoplasmático ou no TGN, enquanto o pequeno GTPA se acumula no citosol, prossiga para perseguir a proteína repórter até a superfície celular na presença de cicloheide para evitar a síntese de proteínas.

Finalmente, rotule a proteína repórter na superfície celular para análise de imunofluorescência. Os resultados obtidos neste ensaio permitem visualizar a mudança na localização da superfície por meio de microscopia confocal. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes como trans transfect é que durante os curtos tempos de superexpressão alcançados com micro injeção, os efeitos secundários são mínimos, permitindo-nos estudar os efeitos primários das proteínas de interesse.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da polaridade celular, como o quão pequeno o gtpa regula o tráfego de membrana polarizada. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas individuais necessárias para uma microinjeção bem-sucedida são difíceis de explicar sem ajuda visual Isole o DNA de plasma livre de endotoxina com o kit de preparação maxi livre de endotoxina Sigma Aldrich de acordo com o protocolo do fabricante. Para este experimento, use três filtros transwell transparentes de 12 milímetros de poro de 0,4 micrômetro para cultivar.

As células assentam quatro vezes 10 das quintas células MDCK em cada filtro. Após dois dias, examine a cultura ao microscópio para verificar se as células estão crescendo em uma monocamada fechada. Para microinjeção.

No dia da microinjeção, prepare placas de 360 por 15 milímetros de cinco litros de meios de crescimento MM mais 15 milímetros de heis e coloque-as em uma incubadora de 39 graus Celsius. Além disso, prepare três placas de 12 poços de um mililitro de meio de crescimento MEM mais 50 milimolares e 0,1 miligrama por mililitro de cicloheximida e coloque-as em uma incubadora de 31 graus Celsius. Ligue o microscópio de microinjeção, configurado como este microscópio invertido com platina aquecida 10 x e 32 x objetivas, e um jato einor femto.

Defina o palco aquecido para 39 graus Celsius. Abra também o suprimento do tanque de gás nitrogênio para a mesa de ar. Agora dilua o DNA com água filtrada até uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro.

Em seguida, gire o DNA em uma microcentrífuga einor a 13.000 RPM por 30 minutos. Remova a parte superior e coloque em um novo tubo. Em seguida, prepare as células MDCK retirando o primeiro filtro de sua placa de cultura com a lâmina cirúrgica, corte o filtro do porta-filtro e coloque-o na placa preparada de 60 por 15 milímetros contendo cinco mililitros de meio de crescimento MEM aquecido a 39 graus Celsius mais 50 heis milimolares.

Para pesar o filtro na placa de cultura, coloque a lâmina cirúrgica no centro do filtro e, em seguida, transfira a placa de cultura para o estágio aquecido do microscópio. Carregue dois a três microlitros do DNA diluído em uma agulha de microinjeção. Torça a tampa protetora da agulha e deixe-a cair no chão.

Para posicionar a agulha no suporte, pressione a tecla de menu da injeção e certifique-se de que a válvula esteja desligada. Enrosque a agulha em seu suporte. Cuidado para não enroscar a agulha com muita força.

Como isso pode levar à quebra, pressione a tecla de menu novamente. Portanto, a pressão de compensação aplicada impedirá que o meio seja sugado para dentro da agulha durante o procedimento de microinjeção. Por fim, toque no joystick para apagar o retorno armazenado para abaixar a agulha nas células.

Use a objetiva 10 x e traga a agulha para o feixe de luz acima do líquido. Agora concentre-se nas células. Concentre-se novamente girando a roda de foco 180 graus para cima e encontre a agulha.

Mova lentamente a agulha para o foco. Em seguida, tire-o de foco novamente. Trabalhando para colocar as células em foco novamente.

Traga a agulha para baixo em foco novamente. Repita até que a agulha toque a superfície do meio, momento em que um halo é observado. Continue a atingir o ponto em que as células estão em foco, mas a agulha ainda está difusa fora do plano focal.

Agora mude para a objetiva 32x e encontre as configurações do curso. Defina o limite Z tocando a membrana apical com a ponta da agulha e subtraindo cerca de 10 micrômetros. Como os núcleos estão dispostos aproximadamente 10 micrômetros abaixo da membrana apical.

Agora traga a agulha alguns mícrons para fora do plano focal o mais rápido possível. Mire com a agulha acima do núcleo e pressione e solte o botão de injeção do joystick. Comece com 95 PSI para encontrar a pressão de injeção correta.

Se a pressão for muito alta, as células explodem. Se a pressão for muito baixa, um ponto branco persiste, mas nada mais acontece. Realize uma injeção bem-sucedida envolvendo uma mudança de fase sem uma mudança no tamanho da célula.

Injete de 100 a 500 células dentro do orifício da lâmina cirúrgica que fica nas células. Em seguida, coloque as células com a placa de cultura e a lâmina cirúrgica em uma incubadora de 39 graus Celsius e incube por duas horas. Finalmente, transfira as células para a placa preparada de 12 poços de um mililitro, MEM mais 50 milimolares 0,1 miligrama por mililitro, cicloureto e incube por duas horas a 31 graus Celsius.

Para evitar o branqueamento do sinal GFP expresso, proteja as amostras da luz cobrindo com papel alumínio durante todos os procedimentos subsequentes de coloração da superfície. Coloque as células em uma placa de cultura em uma placa de metal com gelo e lave. Uma vez com PBS plus plus gelado gelado, posicione um pedaço limpo de paraforma na placa de metal em pipeta de gelo gotas de 30 microlitros de um anticorpo que reconhece o domínio ecto da proteína de interesse.

Agora coloque o filtro contendo células de cabeça para baixo na gota e adicione algumas gotas de anticorpo na parte de trás do filtro. Incube por uma hora no gelo. Lave as células três vezes com PBS plus plus plus gelado e fixe com aldeído paraforme 3% por 15 minutos em temperatura ambiente.

Prossiga para lavar as células uma vez com PBS plus plus e equilibre em PBS plus plus por cinco minutos. Agora incube as células no bloqueio do tampão permeável. Incubar uma hora à temperatura ambiente, diluir os anticorpos primários de um a 200 em BPB para detectar a centrífuga RAB GTP ACE expressa por 10 minutos A 13.000 RPM pipeta, 30 microlitros da solução de anticorpos em um parâmetro limpo colocado em uma câmara úmida.

Coloque as células do filtro de cabeça para baixo sobre as gotas de anticorpos e incube por uma hora. À temperatura ambiente, coloque as células de volta com o lado direito para cima em um 12. Poço e lavagem cinco vezes ao longo de 30 minutos com BPB à temperatura ambiente após incubação com anticorpos secundários apropriados, incluindo uma etapa de lavagem.

Mergulhe as células no filtro três vezes em água deionizada e coloque o lado direito para cima em micro lâminas a 10 microlitros de montagem Coloque um vidro microcoberto de 18 por 18 milímetros em cima e, usando lenços faciais, pressione suavemente a lamínula nas células. Finalmente, sele com esmalte na injeção simulada apenas do plasmídeo que codifica V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. A proteína é entregue à superfície basolateral de células MDCK bem polarizadas, a julgar pela coloração da superfície vermelha em células que não estão bem polarizadas.

Parte da proteína de fusão GFP será entregue à membrana apical. Se as amostras de controle forem assim, os dados não podem ser confiáveis e o experimento deve ser repetido com células polarizadas melhores. Observe que nem toda a fusão expressa para GFP é entregue à membrana basolateral durante a perseguição de 31 graus Celsius, como evidenciado pelo extenso sinal verde intracelular para a proteína total Uma vez dominada, esta técnica deve levar aproximadamente 10 a 12 horas após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do tráfego de membranas explorarem proteínas reguladoras em células epiteliais polarizadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar proteínas em células epiteliais polarizadas usando a técnica de microinjeção.