Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

O objetivo geral deste procedimento é comparar as afinidades relativas dos parceiros de ligação a proteínas para ACEs GT P da família Row sob condições de carga de nucleotídeos cuidadosamente controladas. Isso é feito primeiro purificando supostos parceiros de ligação competitiva, cada um rotulado com a mesma etiqueta, por exemplo, proteína fluorescente verde ou GFP. O segundo passo é purificar o GTPA de interesse.

Por exemplo, RAC um e carregue com o nucleotídeo apropriado para atingir o estado de sinalização GTPA desejado. Em seguida, o gtpa carregado com nucleotídeo é incubado com uma quantidade fixa de um competidor de ligação e quantidades crescentes do outro competidor de ligação para atingir uma curva de ligação de titulação. A etapa final é resolver as proteínas ligadas à passagem GT imobilizada por western blot e sondar a membrana para a etiqueta GFP que é compartilhada entre os dois parceiros de ligação.

Em última análise, o Western blot é usado para identificar as concentrações relativas nas quais quantidades semelhantes de cada parceiro de ligação marcado com GFP são capturadas pela GTPase. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a coprecipitação, é que as propriedades de ligação às proteínas do gtpa são ditadas pelo nucleotídeo ligado na célula. O nucleotídeo ligado é lábil, dificultando a interpretação dos dados de ligação às proteínas.

Comece este procedimento com a purificação de G tpa marcado com GST e expressão de proteínas de ligação a gtpa conforme detalhado no protocolo de texto. RINs os frascos de células transfectadas em tampão fosfato salino ou PBS e drenar o frasco por cinco minutos. Aspirando o líquido livre e, em seguida, raspe as células em 500 microlitros de tampão de lise em um tubo de microfuga, misture as células para lisar por inversão a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Durante a lise, lave dois lotes de 40 microlitros de grânulos de armadilha GFP três vezes com sedimentos tampão de lise frescos. As contas em 2, 700 vezes G por dois minutos entre as lavagens. Após a lise, clarificar os lisados por centrifugação a 21 000 vezes G durante 10 minutos.

Transfira o lisado clarificado de cada uma das proteínas concorrentes para separar os grânulos de armadilha GFP lavados. Permita que as proteínas de fusão GFP se liguem por duas horas, misturando-se por inversão a quatro graus Celsius. Lave os grânulos de armadilha GFP carregados duas vezes em tampão de lise e duas vezes em competição.

Ligação de grânulos de sedimentação tampão a 2.700 vezes G por dois minutos entre as lavagens. Eluir proteínas de fusão GFP adicionando 40 microlitros de glicina 0,2 molar e pipetando para cima e para baixo por 30 segundos sedimentar imediatamente as esferas a 21.000 vezes G por 60 segundos e transferir o líquido para um novo tubo de fuga contendo quatro microlitros de um molar tris HCL execute esta etapa rapidamente para limitar os danos à proteína purificada. Analise um microlitro de cada proteína purificada por western blot e sonde com um anticorpo anti-GFP para estabelecer o rendimento relativo usando um sistema de blotting quantitativo de acordo com o protocolo do fabricante.

Equalize a concentração de proteína molar pela adição de tampão de ligação de competição. Pegue 90 microlitros de grânulos preparados para GST e lave três vezes com tampão de carregamento de nucleotídeos usando um classificador de partículas magnéticas para precipitar os grânulos em cada etapa. Aspire o tampão dos grânulos e adicione 100 microlitros de tampão de carga de nucleotídeos de acordo com a necessidade de G-D-P-G-T-P ou nenhuma carga de nucleotídeos.

Para o experimento de competição, adicione 12 microlitros de 100 milimolares GDP 12 microlitros de 10 milimolares GTP gamma S ou nenhum nucleotídeo a 60 microlitros de grânulos GST rack um para os controles de carregamento de nucleotídeos. Divida as contas restantes em três quats de 10 microlitros e adicione dois microlitros de GDP 100 milimolares, dois microlitros de GTP gama S de 10 milimolares ou nenhum nucleotídeo a cada tubo. Incube as misturas de esferas por 30 minutos a 30 graus Celsius com agitação.

Estabilize o rack ligado a nucleotídeos, um pela adição de um cloreto de magnésio molar à mistura experimental e as misturas de controle Para realizar a ligação de competição. Configure seis tubos de micro fuga. Cada um contendo 200 microlitros de tampão de ligação de competição.

Cada tubo também deve conter 10 microlitros do rack carregado com nucleotídeos, um grânulo e cinco microlitros do rack. Uma proteína de ligação A como uma proteína de ligação constante a cada tubo, adicione 0, 1, 2, 0,55, 10 ou 20 microlitros de proteína B de ligação a um rack como a proteína de ligação variável. Esses volumes assumem concentrações de estoque aproximadamente iguais das proteínas de ligação constantes e variáveis e podem precisar ser ajustados.

Aumente o volume total da mistura de ligação para 235 microlitros por adição do tampão de ligação de competição. Em seguida, configure um tubo de micro fuga contendo 200 microlitros do tampão de competição. 10 microlitros de cremalheira carregada nucleotídeo experimental, um grânulo e 10 microlitros da cremalheira uma proteína obrigatória A.Setup então a gama S de G-D-P-G-T-P e nenhuns tubos de controle do nucleotide como descrito no protocolo do texto.

Incubar os tubos por duas horas misturando por inversão a quatro graus Celsius após a incubação. Lave as contas três vezes com o amortecedor de encadernação de competição. Finalmente, eluir as proteínas ligadas em 20 microlitros de tampão de amostra redutor.

O western blotting quantitativo da marca GFP de GFP RCC purificado dois e GFP Corona em um domínio C.Propeller revela que a proteína na banda superior, GFP RCC dois, é 1,4 vezes mais abundante que a banda inferior e deve ser diluída para atingir uma proporção molar de um para um para o experimento de competição. Um experimento de controle demonstra que o status de carga de nucleotídeos do rack um determina a especificidade de ligação, titulando volumes crescentes de GFP RCC dois contra um volume fixo de GFP equimolar Corona em um domínio de hélice C e blotting. As proteínas que se ligam ao rack um permitem que uma mudança relativa na proteína ligada seja visualizada plotando as intensidades da banda GFP para ambos os competidores no mesmo gráfico e identificando o ponto em que as linhas se cruzam, permite que o volume da proteína de ligação variável em equilíbrio seja identificado.

No entanto, deve-se tomar cuidado para garantir que questões como interação entre concorrentes ou excesso de isca gtpa não comprometam o experimento. Aumento em um concorrente sem perda do outro, como mostrado aqui, indica um problema ao tentar este procedimento. É importante lembrar de verificar se existe uma relação recíproca entre a abundância de parceiros vinculativos concorrentes.

Há uma série de problemas que podem distorcer os resultados e/ou podem ser resolvidos, desde que sejam identificados pela inspeção dos dados.