Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

O objetivo geral deste procedimento é comparar as afinidades relativas de parceiros de ligação proteica por GTPases da família Rho sob condições rigorosamente controladas de carregamento com nucleotídeos. Isso é realizado primeiramente pela purificação de possíveis parceiros competitivos de ligação, cada um marcado com a mesma etiqueta, por exemplo, proteína verde fluorescente ou GFP. O segundo passo consiste na purificação da GTPase de interesse.

Por exemplo, o RAC um é carregado com o nucleotídeo apropriado para atingir o estado desejado de sinalização GTPA. Em seguida, o GTPA carregado com nucleotídeo é incubado com uma quantidade fixa de um competidor de ligação e quantidades crescentes do outro competidor de ligação, a fim de obter uma curva de titulação de ligação. O passo final consiste em separar as proteínas ligadas à GTpase imobilizada por meio de western blot e sondar a membrana para a marcação GFP compartilhada entre os dois parceiros de ligação.

Por fim, o Western blot é utilizado para identificar as concentrações relativas nas quais quantidades semelhantes de cada parceiro de ligação marcado com GFP são capturadas pela GTPase. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como co-precipitação, é que as propriedades de ligação proteica da gtpa são determinadas pelo nucleotídeo ligado na célula. O nucleotídeo ligado é lábil, o que dificulta a interpretação dos dados de ligação proteica.

Inicie este procedimento com a purificação da G tpa marcada com GST e a expressão de proteínas ligantes de gtpa conforme detalhado no protocolo textual. Lave os frascos com células transfectadas com solução salina tamponada com fosfato ou PBS e drenar o frasco por cinco minutos. Após aspirar o líquido livre, raspe as células em 500 microlitros de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga e misture as células para lisar por inversão a quatro graus Celsius durante 30 minutos.

Durante a etapa de lise, lave dois lotes de 40 microlitros de microesferas GFP trap três vezes com tampão de lise fresco, sedimentando as microesferas a 2.700 × g durante dois minutos entre cada lavagem. Após a lise, clarifique os lisados por centrifugação a 21.000 × g durante 10 minutos.

Transfira o lisado clarificado de cada uma das proteínas competidoras para esferas de GFP trap previamente lavadas. Incube para permitir que as proteínas de fusão com GFP se liguem durante duas horas, com mistura por inversão a quatro graus Celsius. Lave as esferas de GFP trap carregadas duas vezes com tampão de lise e duas vezes com tampão de competição.

Centrifugar as microesferas em tampão de ligação a 2.700 × g durante dois minutos entre as lavagens. Eluir as proteínas de fusão GFP adicionando 40 microlitros de glicina 0,2 molar e pipetando para cima e para baixo durante 30 segundos; imediatamente centrifugar as microesferas a 21.000 × g durante 60 segundos e transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga contendo quatro microlitros de Tris-HCl 1 molar. Realizar este passo rapidamente para limitar danos à proteína purificada. Analisar um microlitro de cada proteína purificada por western blot e sondar com um anticorpo anti-GFP para determinar o rendimento relativo, utilizando um sistema de transferência quantitativa de acordo com o protocolo do fabricante.

Iguale a concentração molar de proteína pela adição do tampão de ligação competitiva. Retire 90 microlitros dos grânulos de GST da prateleira um preparados e lave três vezes com tampão de carregamento de nucleotídeo, utilizando um separador magnético de partículas para precipitar os grânulos a cada etapa. Aspire o tampão dos grânulos e adicione 100 microlitros de tampão de carregamento de nucleotídeo, conforme necessário, com G-D-P-G-T-P ou sem carregamento de nucleotídeo.

Para o experimento de competição, adicione 12 microlitros de GDP 100 milimolar, 12 microlitros de GTP gamma S 10 milimolar ou nenhum nucleotídeo a 60 microlitros de beads GST-RACK1 para os controles de carregamento de nucleotídeo. Divida os beads restantes em três alíquotas de 10 microlitros e adicione 2 microlitros de GDP 100 milimolar, 2 microlitros de GTP gamma S 10 milimolar ou nenhum nucleotídeo a cada tubo. Incube as misturas de beads por 30 minutos a 30 graus Celsius com agitação.

Estabilize a estrutura carregada com nucleotídeo, adicionando um molar de cloreto de magnésio à mistura experimental e às misturas controle para realizar a ligação competitiva. Prepare seis tubos microcêntrifuga, cada um contendo 200 microlitros de tampão de ligação competitiva.

Cada tubo também deve conter 10 microlitros do suporte carregado com nucleotídeos, uma esfera e cinco microlitros do suporte. Adicione 0, 1, 2, 0,55, 10 ou 20 microlitros do suporte contendo a proteína de ligação A como proteína de ligação constante a cada tubo, e a proteína de ligação B como proteína de ligação variável. Esses volumes pressupõem concentrações estoque aproximadamente iguais das proteínas de ligação constante e variável e podem precisar ser ajustados.

Complete o volume total da mistura de ligação até 235 microlitros pela adição do tampão de ligação competitiva. Em seguida, prepare um tubo de microcentrífuga contendo 200 microlitros do tampão competitivo. 10 microlitros do nucleotídeo experimental carregado no rack, uma pérola e 10 microlitros da proteína de ligação A do rack um. Depois, prepare os tubos controle de G-D-P-G-T-P gamma S e sem nucleotídeo conforme descrito no protocolo do texto.

Incube os tubos por duas horas, misturando por inversão a quatro graus Celsius após a incubação. Lave as esferas três vezes com o tampão de ligação de competição. Por fim, elua as proteínas ligadas em 20 microlitros de tampão amostral redutor.

O western blot quantitativo da marcação GFP de GFP RCC dois e GFP Corona em um domínio C-Propeller purificados revela que a proteína na faixa superior, GFP RCC dois, é 1,4 vez mais abundante do que a faixa inferior e deve ser diluída para alcançar uma proporção molar um para um no experimento de competição. Um experimento controle demonstra que o estado de carregamento de nucleotídeo do rack um determina a especificidade de ligação, titulando volumes crescentes de GFP RCC dois contra um volume fixo de GFP Corona em um domínio C-Propeller equimolar e realizando o blotting. As proteínas que se ligam ao rack um permitem visualizar a alteração relativa na proteína ligada, plotando as intensidades das faixas de GFP para ambos os competidores no mesmo gráfico; a identificação do ponto em que as linhas se cruzam permite determinar o volume da proteína de ligação variável no equilíbrio.

No entanto, é necessário ter cuidado para garantir que problemas como interação entre competidores ou excesso de isca gtpa não comprometam o experimento. O aumento de um competidor sem a perda do outro, conforme mostrado aqui, indica um problema durante a realização deste procedimento. É importante lembrar de verificar se existe uma relação recíproca entre a abundância dos parceiros de ligação competidores.

Existem vários problemas que podem distorcer os resultados e que podem ser resolvidos desde que sejam identificados mediante a inspeção dos dados.