Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

O objetivo geral deste procedimento é derrubar a expressão do gene alvo no DCS por transfecção de RNA SI. Isso é feito primeiro programando o efetor AM Maxin Nucleo. A segunda etapa do procedimento é misturar DCS e siRNA e pipetar a solução celular resultante nos módulos Nucleo QVE.

A terceira etapa do procedimento é colocar a placa na bandeja de transporte amaxa para iniciar o processo de transfecção. A etapa final do procedimento é infectar as células com o vírus para ativar a resposta do interferon. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o knockdown do gene por meio de RTPC quantitativo e Western blotting.

Esta técnica é valiosa para caracterizar vias de sinalização em células dendréticas e pode contribuir para o desenvolvimento de terapias imunológicas baseadas em células dendréticas. Para programar o fator de núcleo de transporte de poços Maxon 96 para transfecção DC, abra um novo arquivo de parâmetros. Selecione o número de poços que você usará para a transfecção padrão arrastando o cursor sobre o diagrama de placa de 96 poços.

Use um mínimo de três poços para agrupar para cada amostra experimental. Agora insira o código do programa na parte um, selecione F, F e i parte dois, selecione 1 68 nos menus suspensos. Em seguida, na caixa de solução, selecione monócito humano em seguida, na opção de controle, selecione padrão e clique em aplicar.

Para incluir um controle sem transfecção, é necessário selecionar poços adicionais no diagrama. Em seguida, na opção de controle, escolha nenhum controle de programa e clique em aplicar novamente. Depois de misturar a solução de afecção do núcleo, deixe-a aquecer até a temperatura ambiente.

Coloque o número de módulos nucleo vete necessários na placa nucleo VETE na orientação correta, conforme mostrado aqui, inserindo o primeiro na rosa um e dois e assim por diante para todos os tubos a seguir. Transfira DCS suficiente de um frasco de cultura de células para um tubo de 50 mililitros para ter 500.000 células por poço para a transfecção, centrifugue as células por 10 minutos a 400 G a quatro graus Celsius e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione solução de afecção nuclear ao tubo e, em seguida, ressuspenda o DCS pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes.

Agora rotule os tubos DPH de acordo com o tratamento específico a ser realizado e, em seguida, divida as células ressuspensas nos tubos marcados. Adicionar o RNA SI a uma concentração final de 0,25 microgramas por 500.000 células aos tubos epi endorf apropriados e, em seguida, misturar as suspensões celulares pipetando. Use RNA SI não-alvo para a amostra de controle sem transfecção.

Em seguida, pipete 20 microlitros da suspensão de células SI RA DC nos módulos nucleo vete de acordo com o layout experimental previamente programado, garantindo que o líquido seja entregue ao fundo do poço, cubra a placa nucleo vete com uma tampa e bata a placa em uma superfície dura algumas vezes para facilitar a remoção de bolhas de ar para transfectar o dcs. Insira a placa nucleo Yvette preparada na bandeja de transporte de 96 poços do nucleo effector. Em seguida, clique no botão carregar e iniciar.

Acompanhe o andamento do processo de transfecção no visor. Uma cruz preta em um fundo verde significa uma transfecção bem-sucedida naquele poço, enquanto uma barra preta em um fundo vermelho significa que não foi bem-sucedida enquanto as células estão sendo transfectadas. Pré-aqueça o meio de crescimento DC após a conclusão do processo de transfecção, remova a placa e adicione 80 microlitros do meio de crescimento DC pré-aquecido a cada poço.

Usando uma pipeta multicanal, incube a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Durante o período de incubação, adicione 100 microlitros do meio de crescimento DC pré-aquecido aos tubos da matriz na mesma orientação da placa nucleocubeta configurada. Após o período de incubação, transfira todos os 100 microlitros das suspensões celulares dos CVEs do núcleo para os tubos de matriz pré-arranjados.

Em seguida, remova e descarte os tubos onde a transfecção não ocorreu. Finalmente, incube os tubos da matriz por 24 horas ou outro intervalo de tempo desejado. Rotule os tubos einor para cada um dos tubos da matriz de incubação.

Em seguida, transfira os tubos de matriz da incubadora para uma capa de cultura de células e agrupe os tubos de matriz para cada amostra experimental no eend dfs pré-rotulado. Em seguida, pelete as células suavemente girando os tubos DPH em uma centrífuga de mesa por 10 minutos. A 400 G, remova o snat ressuspenda as células em meio de crescimento livre de soro contendo o vírus da doença de Newcastle ou NDV em um MOI de um frouxamente.

Cubra as epi endorfinas de forma estéril e depois incube os tubos por 45 minutos. Após este período de incubação, adicione 900 microlitros de meio de crescimento DC e reincube os tubos por mais oito a 10 horas. Para colher os dcs transfectados e infectados.

Pulverize as células girando os tubos einor em uma centrífuga de mesa como antes e remova o monócito snat dcs foram transfectadas com IRNA direcionada a RIG I ou irna de brilho não específico e infectadas com NDV conforme indicado por um sinal de mais ou permaneceram não infectadas conforme indicado por um sinal de menos conforme detectado por knockdown quantitativo de R-T-P-C-R-A de R RGA em 75%No nível de transcrição foi observada uma redução semelhante na expressão de interferon beta. Um efetor a jusante de RGA na cascata de sinalização de interferon também foi observado. Além disso, a expressão de interferon beta em células transfectadas de controle não infectadas não foi detectável.

Enquanto o de MXA e o gene de resposta a jusante do interferon beta foram mínimos. Aqui. Os dados de uma segunda transfecção de DD com rigi direcionado ao irna realizada como na figura anterior são mostrados neste experimento. No entanto, todas as células estão infectadas com NDV e um controle adicional usando DCS de monócitos não ressecados foi incorporado.

Os resultados do silenciamento gênico foram semelhantes aos observados na figura anterior. Um western blot sondado para RGA revelou que a expressão proteica desse gene havia sido completamente bloqueada. As pistas um e dois mostram dados para lisados de células não ressecadas.

As pistas três e quatro mostram lisados de células transfectadas com glow irna e as pistas cinco e seis mostram lisados de células transfectadas com RIG I visando S Irna Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora, incluindo a derrubada de muitos genes simultaneamente.