ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O projecto foi apoiado pelo NIH Contrato n º HHSN2662000500021C NIAID. Agradecemos Ming Chen por sua assistência técnica.

1. O programa Amaxa 96 poços Nucleofector shuttle <ol><li> Abra um arquivo novo parâmetro. </li><li> Selecione o número de poços que será utilizado para a transfecção padrão, arrastando o cursor sobre o diagrama de placa de 96 poços. Use um mínimo de três poços para piscina para cada amostra experimental. </li><li> Introduza o código do programa: em part1 selecionar 'FF' e em part2 selecionar '168 'do pull down menus </li><li> De 'monócitos humanos, "Solução caixa de seleção </li><li> Na Opção de Controle, selecione 'standard'. </li><li> Clique em Aplicar. </li><li> Para incluir um controle não-transfecção, selecione poços adicionais a partir do diagrama conforme necessário e, em seguida, escolha a opção 'Sem Controle Program' Opção de Controle e clique em Aplicar. </li><li> Selecione qualquer cavidades remanescentes não utilizadas no diagrama de placa e clique em Cancele. </li></ol> 2. Prepare DCs para transfecção <ol><li> Todo o trabalho deve ser feito sob condições estéreis em uma capa de cultura de células, sempre que possível. Preparar a solução adicionando nucleofection de 96 poços suplemento para monócitos humanos de 96 poços Solução Nucleofector na proporção de 450 a 2025. Misture e deixe à temperatura ambiente. Você vai precisar de 20μl de solução nucleofection por poço. Faça um excesso de 10% para permitir a pipetagem erro. </li><li> Coloque o número de módulos nucleocuvette que você precisa na placa nucleocuvette no ie orientação correta de inserir o primeiro em que as linhas 1 e 2. </li><li> Determinar o número de DCs necessários para a sua experiência em cálculo de 500.000 células por poço e pellet por centrifugação a 400g por 10min. Remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células na solução nucleofection cuidado pipetando para cima e para baixo algumas vezes. </li><li> Divida o volume correto de células ressuspendido em eppendorfs etiquetados para o tratamento especial por exemplo GLO e RIG-I. </li><li> Adicionar siRNA 0.25μg por 500.000 células e misture por pipetagem. Use siRNA não-alvo na sua amostra de controlo não-transfecção. </li><li> Pipetar 20μl das misturas acima para os módulos de nucleocuvette, de acordo com seu layout experimental, garantindo que o líquido é enviado para o fundo do poço. </li><li> Cobrir a placa nucleocuvette com a tampa e toque a placa sobre uma superfície dura um par de vezes para ajudar a garantir a remoção de bolhas de ar. </li></ol> 3. Transfectar DCs <ol><li> Inserir placa na bandeja de shuttle Nucleofector de 96 poços, clique em Enviar e, em seguida, começar. </li><li> Acompanhar o progresso do processo de transfecção no visor lap top, uma cruz negra sobre um fundo verde significa uma transfecção bem sucedido em que o bem, ao passo que uma barra preta em um fundo vermelho significa que ele não teve sucesso. </li><li> Após a conclusão do processo de transfecção, retire a placa e adicionar Pipete 80 da DC meio de crescimento a cada poço usando uma pipeta multicanal. </li><li> Incubar placa por 10 min a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Transferir o volume de 100μl do nucleocuvettes em tubos de matriz contendo 100μl de pré-aquecido meio de crescimento DC, mantendo a orientação correta. </li><li> Retire e deite fora os tubos onde transfecção não ocorreu. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 para o intervalo de tempo de 24 horas ou outro desejado. </li></ol> 4. Infectar as células com NDV <ol><li> Remova os tubos da matriz da incubadora para a capa de cultura de células e tubos piscina para cada amostra experimental em eppendorfs </li><li> Agregar as células delicadamente girando em uma centrífuga desk top por 5 minutos e retire o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células no soro livre de meio de crescimento contendo NDV em um MOI de 1 e incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 45 min, com eppendorfs vagamente coberta de uma forma estéril. </li><li> Adicionar 900μl de meio de crescimento DC, e re-incubar por 8-10 h. </li></ol> 5. Células colheita <ol><li> Células de pelotas por fiação eppendorfs em uma centrífuga desk top e remover o sobrenadante. </li><li> Células colheita para RNA ou extração de proteínas de acordo com o protocolo. </li></ol> 6. Resultados representativos: Usando nosso protocolo otimizado que transfectadas DCs com RIGI-targeting siRNA por 24 horas e, em seguida, as células infectadas com o NDV (a paramixovírus detectado pelo RIG-I) para estimular o trajeto resposta interferon. Por qRT-PCR demonstramos knock down do gene em 75% no nível de transcrição. Observamos também uma redução semelhante na expressão de IFNβ, que é uma a jusante efetoras de RIG-I na cascata de sinalização IFN. Além disso, observou-se que a expressão de IFNβ em não-infectados, controle de células transfectadas não foi detectado enquanto o de MxA, um gene de resposta IFNβ a jusante, foi mínima (Figura 1A). A transfecção segunda DCs com RIGI-targeting siRNA foi realizada utilizando células suficientes para incluir a análise de Western blot. Onde oRT-PCR, os resultados foram semelhantes ao que vimos anteriormente (62% e 66% de derrubar RIG-I e expressão IFNβ respectivamente) (Figura 1B), o Western blot sondado para RIG-I revelou que a expressão desse gene foi completamente bloqueada (Figura 1C). <img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="Figura 1A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1A"> Figura 1. (A) MoDCs foram transfectadas com siRNA alvo tanto RIG-I ou siRNA GLO inespecíficos eo efeito sobre a expressão de RIG-I IFNβ e MxA determinada por qRT-PCR. O protocolo de transfecção utilizado um buffer de monócitos específico e um programa de nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Após a incubação por 24 h, as células transfectadas ou foram infectadas com o NDV (+) ou para a esquerda não infectados (-). Após incubação de mais de 10 h, as células foram colhidas e os níveis de Transcrição RNA extraído representam os resultados de dois experimentos replicar. Tomado de Bowles et al 16. (B) MoDCs obtidos a partir de um revestimento buffy diferentes, usado para a Figura 1A foram novamente transfectadas com um RIG-I-alvo siRNA siRNA ou GLO inespecífica utilizando o protocolo de transfecção mesmo que acima. Um controle adicional usando MoDCs untransfected foi incorporado ao experimento. Após uma 24 horas de incubação todas as células foram infectadas com o NDV e incubados por um h mais 10 antes de ser colhida para ambos RNA e extração de proteínas. Níveis de transcrição de RIG-I IFNβ e MxA conforme determinado pelo qRT-PCR representam os resultados de dois experimentos replicar. Tomado de Bowles et al 16. (C) Lisados ​​de células descrito na Figura 1B acima foram analisados ​​por Western blot. Pistas 1 e 2, lisados ​​de células untransfected; faixas 3 e 4, lisados ​​de células transfectadas siRNA GLO; pistas 5 e 6, lisados ​​de células transfectadas com siRNA RIG-I-alvo. As amostras foram sondados para RIG-I e também GAPDH (como um controle de carga) e foram executados em duplicata. Tomado de Bowles et al 16.

<ol><li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dendritic+cells%3A+translating+innate+into+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li>
<li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li>
<li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+%28MUC-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li>
<li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li>
<li>Aicher, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells%3A+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li>
<li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li>
<li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li>
<li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+and%2For+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li>
<li>Roth, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li>
<li>Tendeloo, V. F. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells%3A+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporation+of+dendritic+cells%3A+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li>
<li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+%28siRNA%29+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li>
<li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li>
<li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li>
<li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Transfecção eficiente de células dendríticas naïve primário é importante para a análise de elevada capacidade e engenharia reversa de celulares vias inflamatórias nesta célula-chave mediando a transição inata-imune adaptativo. No entanto, a maioria dos investigadores acham que essas células são difíceis de transfecção tanto de forma eficiente e sem a maturação das células transfecção procedimento de indução ao usar técnicas de transfecção padrão. Nós investigamos se essas limitações poderiam ser superadas através da opt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipamento / Reagente </th><th> Companhia </th><th> Catálogo # </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector de 96 poços Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Número de série </td></tr><tr><td> Amaxa Humanos monócitos de 96 poços Kit Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> VHPA de 2007 </td><td> Contém os monócitos humanos de 96 poços Solução Nucleofector, o Suplemento de 96 poços e as Nucleocuvettes e placas </td></tr><tr><td> RIG-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012.511-00 </td><td></td></tr><tr><td> SiRNA GLO </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Suplementado com 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / ml para fazer DC meio de crescimento </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> HyClone </td><td> 3.070,03 </td><td></td></tr><tr><td> As células dendríticas </td><td> New York Blood centro </td><td></td><td> DCs são purificados de casacos buffy usando um procedimento padrão </td></tr></tbody></table>

protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

As células dendríticas (DCs) podem ser considerados sentinelas do sistema imune que desempenham um papel fundamental no seu início e resposta à infecção 1. Detecção de antígeno patogênicos por DCs naïve é através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que são capazes de reconhecer estruturas específicas conservadas referido como patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs). Detecção de PAMPs por DCs desencadeia uma cascata de sinalização intracelular, resultando em sua ativação e transformação para DCs maduras. Este processo é normalmente caracterizada pela produção de interferon tipo 1, juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias, upregulation de marcadores da superfície celular como MHCII e CD86 e migração da DC maduro para os linfonodos de drenagem, onde a interação com as células T inicia a resposta imune adaptativa 2, 3. Assim, DCs ligação dos sistemas imune inata e adaptativa. A capacidade de dissecar as redes moleculares subjacentes DC resposta a vários patógenos é fundamental para uma melhor compreensão da regulação destas vias de sinalização e seus genes induzidos. Ele deve também ajudar a facilitar o desenvolvimento de DC baseado em vacinas contra doenças infecciosas e tumores. No entanto, esta linha de pesquisa tem sido severamente impedido pela dificuldade de transfecting DCs primários 4. Métodos de transdução de vírus, como o sistema lentiviral, são normalmente utilizados, mas carregam muitas limitações, como a complexidade e bio-perigosos risco (com os custos associados) 5,6,7,8. Além disso, a entrega de produtos do gene viral aumenta a imunogenicidade dos transduzidas DCs 9,10,11,12. Eletroporação tem sido usado com resultados mistos 13,14,15, mas somos os primeiros a relatar o uso de um protocolo de transfecção de alto rendimento e demonstrar conclusivamente a sua utilidade. Neste relatório, resumem um protocolo otimizado comercial para high-throughput transfecção de DCs humanas primárias, com limitada toxicidade celular e uma ausência de maturação DC 16. Eficiência de transfecção (GFP de plasmídeo) e viabilidade celular foram mais de 50% e 70%, respectivamente. FACS análise estabeleceu a ausência de aumento da expressão do CD86 e marcadores de maturação MHCII em células transfectadas, enquanto qRT-PCR não demonstrou upregulation de IFNβ. Usando este protocolo eletroporação, que fornecem evidências de sucesso da transfecção com siRNA DCs e eficaz knock down do gene alvo RIG-I, um receptor de reconhecimento chave viral 16,17, em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

As células dendríticas (CDs) podem ser consideradas sentinelas do sistema imunológico, desempenhando um papel fundamental na sua iniciação e na resposta à infecção1. A detecção ...

O objetivo geral deste procedimento é silenciar a expressão gênica-alvo em DCS por meio da transfeção com RNAi. Isso é realizado primeiramente programando o efetor AM Maxin Nucleo. O segundo passo do procedimento consiste em misturar DCS e siRNA e pipetar a solução celular resultante nos módulos Nucleo QVE.O terceiro passo do procedimento é colocar a placa na bandeja do shuttle amaxa para iniciar o processo de transfeção. O passo final do procedimento é infectar as células com o vírus para ativar a resposta ao interferon. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a redução gênica por meio de R-T-P-C-R quantitativa e Western blotting.Essa técnica é valiosa para caracterizar vias de sinalização em células dendríticas e pode contribuir para o desenvolvimento de terapias imunológicas baseadas em células dendríticas. Para programar o nucleofactor Maxon de 96 poços para transfeção de DC, abra um novo arquivo de parâmetros. Selecione o número de poços que você utilizará para transfeção padrão, arrastando o cursor sobre o diagrama da placa de 96 poços.Utilize no mínimo três poços para agrupar cada amostra experimental. Agora, insira o código do programa na parte um, se

optimized-protocol-for-efficient-transfection-dendritic-cells-without

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma pequena técnica baseada em RNA interferente (siRNA) para interferir no fluxo autofágico. Um siRNA direcionado ao mRNA de FIP200 é introduzido em células dendríticas imaturas derivadas de monócitos (iDCs) usando eletroporação, causando o knockdown da expressão de FIP200 e levando à inibição da ruptura da lâmina nuclear por autofagia. Ao adicionar o vírus herpes simplex (HSV), a saída nuclear da progênie viral é inibida devido à ausência de ruptura da lâmina via fluxo...

Inibição da autofagia baseada em siRNA em células dendríticas imaturas infectadas pelo vírus Herpes Simplex

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

A eletroporação de próxima geração é um método eficiente para transfectar células Th17 humanas com pequenos RNAs para alterar a expressão gênica e o comportamento celular.

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.

Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Este protocolo descreve a reprogramação in vivo de células cancerígenas de camundongo em células dendríticas tipo 1 dentro do microambiente tumoral por meio da expressão forçada dos fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3.

Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

Aprenda um protocolo de nucleofeção otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas humanas derivadas de monócitos com siRNA ou DNA plasmidial, sem induzir maturação celular. Este método permite silenciamento gênico eficaz de genes como RIG-I, verificado por RT-PCR quantitativa e Western blot, sendo valioso para estudos de respostas imunes e terapias baseadas em células dendríticas.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Explorar mais vídeos