Name: HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a expandir linfócitos T citotóxicos humanos específicos de antígeno usando células apresentadoras de antígeno artificiais baseadas em HLA A2-Ig. Este método oferece vantagens para imunoterapia adotiva.

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Gostaríamos de agradecer a Aaron Selya para discussão útil. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder AI29575, CA108835, AI077097 de JS, uma bolsa-piloto da Johns Hopkins Malaria Research Institute e do Departamento de Defesa conceder PC 040972 para MO

1. Fazendo, HLA-A2-Ig baseada AAPC <ol><li> Prepare tampão borato estéril <ol><li> Dissolver o ácido bórico em água para fazer 0,1 M. Ajustar o pH para 7,0. </li><li> Filtrar através de filtro estéril 0.22μm e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare tampão de lavagem estéril Bead <ol><li> Tome 956ml PBS magnésio w / o ou cálcio. </li><li> Adicionar 30ml de soro humano AB. </li><li> Adicionar EDTA 2mM concentração final. </li><li> Adicionar 0.1gsodium azida. </li><li> Filtrar com um filtro de 0,22 mM estéril e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Tomar 1ml de contas Invitrogen M-450 Epoxy do estoque, aproximadamente 400 milhões de contas (contas pode ser contado por hemocitômetro), e colocado em um, frasco de vidro estéril parafuso superior. </li><li> Colocar o frasco contra um ímã Dynal MPC-1, enquanto as contas aderir à parede do frasco, retire o sobrenadante por aspiração. Lavar contas uma vez com 1ml de tampão borato. </li><li> Contas ressuspender em uma mistura de tampão borato 1ml e 20 mcg de HLA-A2-Ig dímero e 20 mg de anti-CD28 humano mAb (Clone 9.3). </li><li> Proteína para a conjugação talão: coloque o frasco de vidro sobre rotador e gire a 4 ° C por 24 horas. </li><li> Colocar o tubo no MPC-1 ímã e remover todos tampão borato. </li><li> Lave as contas duas vezes com tampão de lavagem 1ml Bead. </li><li> Incubar as contas em tampão de lavagem 1ml Bead, gire a 4 ° C por 24 horas. Porque tampão de lavagem contém Bead humana soro AB, ele irá bloquear todos os sites de proteína residual vinculativo sobre as contas. </li><li> Remover o sobrenadante do frasco de vidro, substitua por 1 ml tampão de lavagem fresca Bead. </li></ol> 2. Controle de qualidade dos AAPC e peptídeo de carga, armazenamento <ol><li> Adicionar ~ 5 × 10 5 contas para FACS 100μl tampão de lavagem em tubos FACS, e mancha com 1μl de anti-mouse IgG1-PE (reconhecer a parte Fc de HLA-A2-Ig) e 1μl de anti-mouse IgG2a-FITC (reconhecer a parte Fc de anti-CD28 mAb). Após coloração por 20 minutos em FACS tampão de lavagem, lave novamente e ler o resultado coloração imediatamente por citômetro de fluxo (Figura 4). </li><li> Loading peptídeo para as contas: lavar as contas duas vezes em frasco de vidro com 1 ml estéril PBS. Ressuspender com 1ml de PBS estéril, em seguida, adicionar 10μl de peptídeo CMV (1mg/ml) </li><li> Contar as contas por hemocitômetro, e rotular o frasco com data e concentração. </li><li> AAPC está pronto para uso após pelo menos 3 dias de incubação peptídeo a 4 ° C, para dar tempo suficiente de ligação de peptídeos para o dímero HLA-A2-Ig. As esferas podem ser armazenados a 4 ° C e permanecer funcional por pelo menos seis meses. </li></ol> 3. CTL isolamento humano <ol><li> Coletar ~ 100ml de sangue periférico fresco de doadores HLA-A2 saudável e positiva em 10 de sódio BD tubos Vacutainer Heparina. Use uma agulha calibre 21 ou maior para evitar a hemólise. </li><li> Centrifugar a 300xg por 10 minutos em temperatura ambiente </li><li> Remova cuidadosamente a camada de plasma topo por aspiração. O plasma pode ser utilizado como suplemento para o meio de cultura. </li><li> Substituir o plasma coletado com PBS estéril e transferir o sangue para um balão de cultura estéreis T75 ou tubos cônicos de 50ml. Misturar o sangue com PBS bem pipetando cima e para baixo. </li><li> Uma vez que todo o sangue é coletado, prepare mais quatro tubos de 50ml cónico e adicionar 15ml de Ficoll-Paque Plus. </li><li> Lentamente sobreposição de 30 35ml de células do sangue em cima do Ficoll de cada tubo. Manter a interface entre as distintas Ficoll e células do sangue. </li><li> Centrifugar a 500xg por 20 minutos em temperatura ambiente. Ligue o freio "off" ea aceleração tão baixo quanto possível manter uma relação clara entre as camadas. </li><li> Com uma pipeta serológico, aspirar cuidadosamente a camada de PBMC e recolher o CMSP em um tubo cônico de 50ml fresco. Quando todas as PBMC são colhidas adicionar 30ml de PBS e giram em 400xg por 10 min. Desprezar o sobrenadante e lavar mais uma vez com PBS 30ml para remover todos os Ficoll residual. </li><li> Proceder para isolamento de células CD8 + T usando Miltenyi humana CD8 + T kit de isolamento de células de acordo com o protocolo do fabricante. Este kit altamente enriquece de células CD8 + (geralmente&gt; 95%), esgotando CD8 - células. </li><li> Contar as células T CD8 +. A pureza esperada deve ser superior a 95%. Para confirmar essa utilização 2x10 5 células e realizar uma análise CD4/3/8 FACS. O CTL restante pode ser utilizado de imediato para a estimulação antígeno-específica AAPC ou eles podem ser congelados para uso futuro. </li></ol> 4. In vitro sistema de cultivo baseado AAPC <ol><li> Prepare meio de cultura <ol><li> Para TF (T fator de crescimento celular, feita no laboratório 4) 2X meio de cultura: meio RPMI completo, mais 5% de doadores autólogos plasma e 8% T fator de crescimento celular. </li><li plasma de doadores aut pode ser substitu por inativado pelo calor humano ab soro.></ol></li><li> Ressuspender CTL 1 milhão em 8ml de TF meio de cultura 2X mais 8ml de meio RPMI completo, adicionar 1 × 10 AAPC 6, misture bem. </li><li> Use uma pipeta multi-canal para as células em placa de 96 poços fundo U placas de cultura de tecidos. (160 mL por poço) </li><li> Células de cultura em 37 ° C, 5% CO 2 incubater durante 7 dias. Alimentar as células no dia 4 com 80 mL bem TF / médio 2X. </li><li> As células estão prontas para serem colhidas no dia 7. Após a colheita, coloque as células contra o ímã e remova a AAPC de idade. </li><li> Especificidade do antígeno pode ser determinada através da coloração tetrâmero acordo com o protocolo do fabricante. Coloração fenótipo e coloração de citocinas intracelulares são realizadas de acordo com nossos 3 estudo anterior. </li><li> As células podem ser colhidas com replated AAPC novamente sob as mesmas condições. Número de células e especificidade do antígeno é esperado um aumento após a estimulação repetida. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de AAPC após conjugação HLA A2-Ig e anti-CD28 é mostrado na Figura 4. Conjugação de proteínas de sucesso é evidente uma clara mudança de coloração do anticorpo correspondente. Enquanto a freqüência de CMV CTL específicas no sangue periférico é tipicamente 0,5-1%, após uma única semana de AAPC mediada estimulação, a especificidade pode chegar a 55-93% (Figura 2 e 3). A expansão da CTL antígeno específico pode ser muito variável entre os diferentes doadores, mas os resultados são reprodutíveis dentro do mesmo doador. Por extrapolação, a expansão de células CMV específicos podem ser milhares de vezes em comparação com os níveis de precursor diretamente ex vivo (dados não mostrados). Coloração de citocinas intracelulares (Figura 3) mostra que essas CTL expandidas são polifuncionais, ao invés de exausto, depois de cultura de células prolongada e proliferação significativa. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gráfico Representante fluxo de expansão vivo baseado ex AAPC de CTL humanos para imunoterapia adotiva em alogênico HSCT <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante resultado coloração tetrâmero de CMV CTL específicos gerados por AAPC após uma semana de cultura <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Resultado coloração intracelular de citocinas Representante da CMV CTL específicos gerados pela AAPC (CMV especificidade foi de 61%) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Coloração resultado Representante do M-450 contas Epoxy após conjugação de proteínas marcadas com anti-camundongo IgG1-PE e anti-mouse IgG2-FITC

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O sistema AAPC descrevemos aqui é um sistema eficiente para a expansão ex vivo de CTL humana contra uma variedade de antígenos. Cuidados especiais devem ser tomados com relação à qualidade da conjugação de proteínas e distribuição uniforme da AAPC e CTL na cultura placa de 96 poços. Usando essa abordagem, temos sido capazes de expandir CTL por mais de oito semanas, durante a qual expandiu-antígeno específico CTL até um milhão de vezes 4. Houve vários sistemas APC artificial utilizando linhas celulares ou outras plataformas acelular 5, no entanto, de acordo com os dados publicados a cada sistema tem seu perfil único no que diz respeito à expansão e especificidade suporte a aplicações diferentes. Importante, uma vez que a qualidade do CTL é tão importante como a quantidade, o polyfunctionality do CTL CMV-específico gerado pelo nosso sistema são esperadas para conferir eficiência anti-viral superior.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Vacutainer tubo (contém heparina) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> Humana CD8 + T kit de isolamento de células </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads Epoxy M-450 </td><td> Invitrogen </td><td> 140,11 </td></tr><tr><td> Dynal Magnet MPC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01D </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-Ig dímero X </td><td> Becton Dickinson </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetrâmero (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> Falcon clara de 96 poços da placa de microtitulação </td><td> Becton Dickinson </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> Rato anti-rato IgG2a-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> Cabra anti-rato IgG1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> Soro humano tipo AB </td><td> Atlanta biológicos </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> Camundongo anti-humano-FITC CD8a </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> Camundongo anti-humano CD8a-APC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> Camundongo anti-humano-FITC IFNγ </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> Camundongo anti-humano TNFa-PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig baseado artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente ex vivo ampliação da ctl humanos

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL com função efetora ideal desempenham papéis críticos na mediação proteção contra diversas infecções intracelulares e câncer. No entanto, os indivíduos podem apresentar microambiente imune supressivo e, em contraste com a ativação CTL, as suas células autólogas apresentando antígeno pode tender a tolerize ou anergize CTL antígeno específico. Como resultado, embora ainda em fase experimental, baseada em CTL imunoterapia adotiva evoluiu para se tornar um tratamento promissor para diversas doenças, como câncer e infecções por vírus. Em experimentos ex vivo inicial expandiu CMV (citomegalovírus) CTL específicos têm sido utilizados para o tratamento de infecção por CMV em pacientes imunocomprometidos óssea alogênico transplante de medula. Embora seja comum ter a vida em risco viremia CMV nesses pacientes, nenhum dos pacientes que receberam expandiu CTL CMV desenvolver doenças relacionadas, implicando a imunidade anti-CMV é estabelecido pela CTL adotivamente transferidos 1. Resultados promissores também têm sido observados para melanoma e pode ser estendido para outros tipos de câncer 2. Embora existam muitas maneiras de ex vivo estimular e expandir CTL humanos, abordagens atuais são restritas pelas limitações de custo e técnicas. Por exemplo, o padrão ouro atual é baseado no uso de DC autólogo. Isso exige de cada paciente para doar um número significativo de leucócitos e também é muito caro e trabalhoso. Além disso, detalhada caracterização in vitro da DC expandiu CTL revelou que estes só têm função efetora suboptimal 3. Aqui apresentamos um sistema altamente eficiente baseada AAPC para a expansão ex vivo de CTL CMV humano específico para a imunoterapia adotiva (Figura 1). A AAPC foram feitas pelo acoplamento de células de tamanho esferas magnéticas com humano HLA-A2-Ig dímero e anti-CD28mAb 4. Uma vez AAPC são feitos, eles podem ser carregados com vários peptídeos de interesse, e permanecer funcional por meses. Neste relatório, AAPC foram carregados com um peptídeo dominante da CMV, pp65 (NLVPMVATV). Após o cultivo humano purificado CD8 + CTL de um doador saudável com AAPC por uma semana, CMV CTL específica pode ser aumentado dramaticamente na especificidade até 98% (Figura 2) e ampliado mais de 10.000 vezes. Se mais CTL CMV-específicos são necessários, uma maior expansão pode ser facilmente alcançado por estimulação repetitiva com AAPC. Caracterização fenotípica e funcional mostra estas células expandidas têm fenótipo efetor uma memória e fazer uma quantidade significativa de ambos os TNFa e IFNγ (Figura 3).

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

Os CTLs com função efetora ideal desempenham papéis críticos na mediação da proteção contra diversas infecções intracelulares e o câncer. No entanto, indivíduos...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar células apresentadoras de antígeno artificiais ou uma APC para a expansão ex vivo de CTL humanos específicos por antígenos, com possível aplicação em imunoterapia adotiva. Isso é realizado primeiramente conjugando HLA A2-Ig e anticorpo monoclonal anti-CD28 humano a microesferas magnéticas Dynabeads para produzir uma APC. O segundo passo do procedimento é realizar o controle de qualidade e o carregamento com peptídeos da APC. O terceiro passo do procedimento é isolar células T CD8 positivas do sangue periférico humano. O passo final do procedimento é incubar as células T CD8 positivas com a APC por uma semana.Os CTL são então colhidos e caracterizados antes de serem utilizados ou reestimulados por mais uma semana para atingir o nível desejado de sua especificidade e expansão. Em última análise, podem ser obtidos resultados de tetraméricos ou coloração que demonstram que os CTL expandidos na presença de A A PC apresentam uma especificidade antigênica aumentada. Hoje vou mostrar a vocês um sistema A A PC baseado em HI IG e como utilizar este sistema para expandir eficientemente CTL humanos específicos para CMV ex vivo, em comparação com outros métodos existentes.Nossa tecnologia A A PC oferece diversas vantagens importantes. Está prontamente disponível comercialmente, possui quantidade ilimitada e, digamos, o A A PC pode ser utilizado para todos os doadores HRAA dois positivos. Ok, vamos começar: transfira um mililitro de microesferas de epóxi M quatro 50 de um estoque com aproximadamente 400 milhões de microesferas para um frasco de vidro estéril com tampa rosqueável.Lave as microesferas uma vez adicionando um mililitro de tampão boid e, em seguida, colocando o frasco de vidro contra um ímã NBC um enquanto as microesferas aderem à parede do frasco. Remova o sobrenadante por aspiração. Suspender as microesferas em uma mistura de tampão boid, dímero HLA A dois IG e anticorpo monoclonal anti-humano CD 28.Em seguida, para facilitar a conjugação da proteína aos grânulos, gire o frasco de vidro em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 24 horas. A seguir, coloque o tubo em um ímã MPC1 e remova todo o tampão borato. Após a remoção do tampão, lave os grânulos duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem de grânulos.Agora, incube as esferas em um mililitro de tampão de lavagem das esferas e gire o frasco a quatro graus Celsius por mais 24 horas para bloquear os sítios residuais de ligação proteica nas esferas. Em seguida, remova o tampão do frasco de vidro e substitua por um mililitro de tampão de lavagem fresco. Transfira 100 microlitros de tampão de lavagem para tubos fax e, então, adicione cinco vezes 10 à quinta esferas.Marque as microesferas com um microlitro de IgG anti-murino um PE e um microlitro de IgG anti-murino dois a fite após a marcação por 20 minutos a quatro graus Celsius. Adicione três mililitros de tampão de lavagem fax a cada uma das amostras marcadas. Em seguida, pelote o A A PC por centrifugação a 300 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.Reative a A A PC em tampão de fax fresco e leia imediatamente o resultado da coloração por citometria de fluxo. Lave as microesferas duas vezes com PBS estéril, como antes. Em seguida, carregue as microesferas com 10 microlitros do peptídeo de CMV.Conte as microesferas utilizando um hemocitômetro e, em seguida, rotule-as com a data e a concentração das microesferas, em microesferas por mililitro. Incube o A A PC com o peptídeo por pelo menos três dias a quatro graus Celsius. Centrifugue aproximadamente 100 mililitros de sangue periférico fresco de um doador positivo para HLA A dois em tubos vacutainer com 10 de heparina de sódio a 300 Gs durante 10 minutos.À temperatura ambiente, remova cuidadosamente a camada superior de plasma por aspiração. Substitua o plasma coletado por PBS estéril e transfira o sangue para um frasco de cultura estéril do tipo T 75. Misture bem o sangue e o PBS por pipetagem, logo que todo o sangue tenha sido coletado, atingindo um volume total de 15 mililitros do fial pack mais quatro tubos cônicos de 50 mililitros.Sobreponha lentamente 30 a 35 mililitros das células sanguíneas sobre o fial em cada tubo. Mantendo a interface distinta entre o fial e as células sanguíneas, centrifugue o gradiente de sangue e fial a 500 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente, com a frenagem desativada e a aceleração tão baixa quanto possível, para manter uma interface clara entre as camadas após a centrifugação. Aspire cuidadosamente a camada superior de plasma e, em seguida, use uma pipeta serológica para aspirar cuidadosamente a camada de PBMC. Transfira o PBMC para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Quando todo o PBMC tiver sido coletado, adicione 30 mililitros de PBS às células e centrifugue-as.Em seguida, descarte o sobrenadante e lave o pellet mais uma vez com 30 mililitros de PBS para remover o resíduo celular, depois enriqueça a população de linfócitos T CD8 positivos utilizando um kit de isolamento de linfócitos T CD8 positivos humanos Milton, conforme o protocolo do fabricante. Conte os linfócitos T CD8 positivos e confirme a pureza por meio de análise de citometria de fluxo.Suspenda 1 milhão de CTL em oito mililitros de meio de cultura com fator de crescimento para células T duas vezes (T-cell growth factor two x) mais oito mililitros de meio RPMI completo e adicione uma vez 10 à sexta do mix de A A PC. Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para semear 160 microlitros de células por poço em uma placa de cultura tecidual de 96 poços com fundo em U. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por sete dias.Alimente as células no quarto dia com 80 microlitros por poço de meio de cultura com fator de crescimento para linfócitos T. Recolha as células no sétimo dia e, em seguida, coloque o tubo contra o ímã para remover o A A PC antigo quando todas as microesferas aderirem à parede do frasco.Colete e transfira as células para outro tubo cônico de 50 mililitros e conte o número de células. Determine a especificidade antigênica da APC AA por meio de coloração com tetrâmero, conforme o protocolo do fabricante. Incube novamente as células coletadas com nova APC AA nas mesmas condições para aumentar o número de células com especificidade antigênica.Aqui está um resultado representativo de coloração com tetrâmero de CTL específicas para CMV geradas por A A PC após uma semana de cultivo. É mostrado aqui um resultado representativo de coloração intracelular de citocinas de CTL específicas para CMV geradas por A-A-P-C-C-M-V, cuja especificidade foi de 61% pela coloração com tetrâmero. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área de linfócitos T, como, por exemplo, como identificar as condições ideais de cultivo e os requisitos para a modulação funcional de linfócitos T.O método simples forneceu insights sobre o tratamento de doenças virais. Ele também pode ser aplicado em outros campos, como o câncer.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

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