HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

O objetivo geral deste procedimento é usar células apresentadoras de antígenos artificiais ou um PC A para expansão ex vivo de CTL específico de antígeno humano para uso potencial em imunoterapia adotiva. Isso é feito conjugando primeiro HLA A, dois IG e anticorpo monoclonal anti-CD 28 humano com esferas dinam magnéticas para fazer A A PC. A segunda etapa do procedimento é realizar o controle de qualidade e o carregamento de peptídeos do AA PC. A terceira etapa do procedimento é isolar as células T oito positivas para CD do sangue periférico humano. A etapa final do procedimento é incubar oito células T positivas em CD com um PC A por uma semana.

Os CTL são então colhidos e caracterizados antes de serem usados ou estimulados novamente por mais uma semana para atingir o nível desejado de sua especificidade e expansão. Em última análise, podem ser obtidos resultados de teum ou coloração que mostram que CTL que são expandidos na presença de um PC têm uma especificidade de antígeno aumentada. Hoje vou mostrar a vocês um sistema de PC baseado em HI IG e como usar esse sistema para expandir com eficiência o CTL humano específico para CMV em comparação com outros métodos existentes.

Nossa tecnologia AA PC oferece várias vantagens importantes. Está disponível na prateleira, é de quantidade ilimitada e, digamos que um PC possa ser usado para todos os dois doadores positivos da HRAA. Ok, vamos começar Transfira um mililitro de M quatro 50 contas de epóxi de um estoque de aproximadamente 400 milhões de contas para uma lima de vidro estéril.

Lave as contas uma vez adicionando um mililitro de tampão boid e, em seguida, colocando o frasco de vidro contra um ímã NBC enquanto as contas estão aderidas ao lado do frasco. Remova o snat por aspiração Resus. Suspenda as esferas em uma mistura de tampão boid HLA A dois dímeros IG e anticorpo monoclonal CD 28 anti-humano.

Em seguida, para facilitar a conjugação da proteína com o grânulo, gire o frasco de vidro em um rotador a quatro graus Celsius por 24 horas. Em seguida, coloque o tubo em um ímã MPC e remova todo o tampão de borato. Depois que o tampão for removido, lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem de contas.

Agora incube as esferas em um mililitro de tampão de lavagem de esferas e gire o frasco a quatro graus Celsius por mais 24 horas para bloquear os locais de ligação de proteínas residuais nas contas. Em seguida, remova o tampão do frasco de vidro e substitua-o por um mililitro de tampão de lavagem de contas frescas. Transfira 100 microlitros de tampão de lavagem de fax para tubos de fax e, em seguida, adicione cinco vezes 10 às quintas contas.

Manchar as esferas com um microlitro de IgG anti-musa, um PE e um microlitro de IgG anti-musa dois a fite após coloração por 20 minutos a quatro graus Celsius. A três mililitros de tampão de lavagem por fax para cada uma das amostras de coloração. Em seguida, faça a pelota do PC AA gastando a 300 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Reus suspenda o A A PC em tampão de fax novo e leia o resultado da coloração imediatamente pelo citômetro de fluxo. Lave as contas duas vezes com PBS estéril como antes. Em seguida, carregue as esferas com 10 microlitros de peptídeo CMV.

Conte as contas com hemocitômetro e depois etiquete-as com a data e a concentração das contas. Como contas por mililitro. Incube o AA PC com o peptídeo por pelo menos três dias a quatro graus Celsius, centrifugue aproximadamente 100 mililitros de sangue periférico fresco de um doador HLA A dois positivos em 10 tubos vacutainer de heparina sódica a 300 Gs por 10 minutos.

À temperatura ambiente, remova cuidadosamente a camada superior de plasma por aspiração. Substituir o plasma colhido por PBS estéril e transferir o sangue para um balão de cultura T 75 estéril. Misture bem o sangue e o PBS pipetando uma vez que todo o sangue tenha sido coletado a 15 mililitros de pacote de fial mais quatro tubos cônicos de 50 mililitros.

Cubra lentamente 30 a 35 mililitros de células sanguíneas em cima do fial em cada tubo. Mantendo a interface distinta entre o fial e as células sanguíneas, centrifugue o gradiente sanguíneo e fial a 500 GS por 20 minutos à temperatura ambiente com a interrupção e a aceleração o mais baixa possível para manter uma interface clara entre as camadas após o spin, aspire a camada superior de plasma e, em seguida, use uma pipeta sorológica para aspirar cuidadosamente a camada PBMC. Transferir o PBMC para um novo tubo cónico de 50 mililitros quando todo o PBMC tiver sido colhido a 30 mililitros de PBS para as células e centrifugá-los.

Em seguida, descarte o supernat e lave o pellet. Mais uma vez com 30 mililitros de PBS para remover a chamada de fi residual e, em seguida, enriquecer para a população de células T positivas para CD oito usando um kit de isolamento de células T positivas para CD humano Milton. De acordo com o protocolo do fabricante, conte as oito células T positivas do CD e confirme a pureza por análise de fax.

Suspenda 1 milhão de CTL em oito mililitros de fator de crescimento de células T dois x meio de cultura mais oito mililitros de meio RPMI completo e adicione uma vez 10 da mistura de seis A A PC. Bem, então use uma pipeta multicanal para colocar 160 microlitros de células por poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo U de 96 poços. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por sete dias.

Alimente as células no quarto dia com 80 microlitros por poço de crescimento de células T. Fator dois x meio de cultura. Colha as células no sétimo dia e, em seguida, coloque-as contra o ímã para remover o antigo A A PC quando todas as contas aderirem à parede do frasco.

Colha e transfira as células para outro tubo cônico de 50 mililitros e conte o número de células. Determine a especificidade do antígeno do AA PC por coloração de tetrâmero de acordo com o protocolo do fabricante. Reproduza as células colhidas com o novo A A PC nas mesmas condições para gerar um número maior de células em especificidade de antígeno.

Aqui está um resultado representativo da coloração do tetrâmero de CTL específico para CMV gerado por AA PC após uma semana de cultura. Aqui é mostrado um resultado representativo de coloração de citocinas intracelulares de CTL específico para CMV gerado pela especificidade de A-A-P-C-C-M-V foi de 61% pela coloração de tetrâmero. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no campo das células T, como podemos identificar as condições culturais ideais e os requisitos para a modulação funcional das células T.

O método humilde forneceu informações sobre o tratamento de doenças virais. Também pode ser aplicado em outros campos, como o câncer.