HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

O objetivo geral deste procedimento é utilizar células apresentadoras de antígeno artificiais ou uma APC para a expansão ex vivo de CTL humanos específicos por antígenos, com possível aplicação em imunoterapia adotiva. Isso é realizado primeiramente conjugando HLA A2-Ig e anticorpo monoclonal anti-CD28 humano a microesferas magnéticas Dynabeads para produzir uma APC. O segundo passo do procedimento é realizar o controle de qualidade e o carregamento com peptídeos da APC. O terceiro passo do procedimento é isolar células T CD8 positivas do sangue periférico humano. O passo final do procedimento é incubar as células T CD8 positivas com a APC por uma semana.

Os CTL são então colhidos e caracterizados antes de serem utilizados ou reestimulados por mais uma semana para atingir o nível desejado de sua especificidade e expansão. Em última análise, podem ser obtidos resultados de tetraméricos ou coloração que demonstram que os CTL expandidos na presença de A A PC apresentam uma especificidade antigênica aumentada. Hoje vou mostrar a vocês um sistema A A PC baseado em HI IG e como utilizar este sistema para expandir eficientemente CTL humanos específicos para CMV ex vivo, em comparação com outros métodos existentes.

Nossa tecnologia A A PC oferece diversas vantagens importantes. Está prontamente disponível comercialmente, possui quantidade ilimitada e, digamos, o A A PC pode ser utilizado para todos os doadores HRAA dois positivos. Ok, vamos começar: transfira um mililitro de microesferas de epóxi M quatro 50 de um estoque com aproximadamente 400 milhões de microesferas para um frasco de vidro estéril com tampa rosqueável.

Lave as microesferas uma vez adicionando um mililitro de tampão boid e, em seguida, colocando o frasco de vidro contra um ímã NBC um enquanto as microesferas aderem à parede do frasco. Remova o sobrenadante por aspiração. Suspender as microesferas em uma mistura de tampão boid, dímero HLA A dois IG e anticorpo monoclonal anti-humano CD 28.

Em seguida, para facilitar a conjugação da proteína aos grânulos, gire o frasco de vidro em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 24 horas. A seguir, coloque o tubo em um ímã MPC1 e remova todo o tampão borato. Após a remoção do tampão, lave os grânulos duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem de grânulos.

Agora, incube as esferas em um mililitro de tampão de lavagem das esferas e gire o frasco a quatro graus Celsius por mais 24 horas para bloquear os sítios residuais de ligação proteica nas esferas. Em seguida, remova o tampão do frasco de vidro e substitua por um mililitro de tampão de lavagem fresco. Transfira 100 microlitros de tampão de lavagem para tubos fax e, então, adicione cinco vezes 10 à quinta esferas.

Marque as microesferas com um microlitro de IgG anti-murino um PE e um microlitro de IgG anti-murino dois a fite após a marcação por 20 minutos a quatro graus Celsius. Adicione três mililitros de tampão de lavagem fax a cada uma das amostras marcadas. Em seguida, pelote o A A PC por centrifugação a 300 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Reative a A A PC em tampão de fax fresco e leia imediatamente o resultado da coloração por citometria de fluxo. Lave as microesferas duas vezes com PBS estéril, como antes. Em seguida, carregue as microesferas com 10 microlitros do peptídeo de CMV.

Conte as microesferas utilizando um hemocitômetro e, em seguida, rotule-as com a data e a concentração das microesferas, em microesferas por mililitro. Incube o A A PC com o peptídeo por pelo menos três dias a quatro graus Celsius. Centrifugue aproximadamente 100 mililitros de sangue periférico fresco de um doador positivo para HLA A dois em tubos vacutainer com 10 de heparina de sódio a 300 Gs durante 10 minutos.

À temperatura ambiente, remova cuidadosamente a camada superior de plasma por aspiração. Substitua o plasma coletado por PBS estéril e transfira o sangue para um frasco de cultura estéril do tipo T 75. Misture bem o sangue e o PBS por pipetagem, logo que todo o sangue tenha sido coletado, atingindo um volume total de 15 mililitros do fial pack mais quatro tubos cônicos de 50 mililitros.

Sobreponha lentamente 30 a 35 mililitros das células sanguíneas sobre o fial em cada tubo. Mantendo a interface distinta entre o fial e as células sanguíneas, centrifugue o gradiente de sangue e fial a 500 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente, com a frenagem desativada e a aceleração tão baixa quanto possível, para manter uma interface clara entre as camadas após a centrifugação. Aspire cuidadosamente a camada superior de plasma e, em seguida, use uma pipeta serológica para aspirar cuidadosamente a camada de PBMC. Transfira o PBMC para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Quando todo o PBMC tiver sido coletado, adicione 30 mililitros de PBS às células e centrifugue-as.

Em seguida, descarte o sobrenadante e lave o pellet mais uma vez com 30 mililitros de PBS para remover o resíduo celular, depois enriqueça a população de linfócitos T CD8 positivos utilizando um kit de isolamento de linfócitos T CD8 positivos humanos Milton, conforme o protocolo do fabricante. Conte os linfócitos T CD8 positivos e confirme a pureza por meio de análise de citometria de fluxo.

Suspenda 1 milhão de CTL em oito mililitros de meio de cultura com fator de crescimento para células T duas vezes (T-cell growth factor two x) mais oito mililitros de meio RPMI completo e adicione uma vez 10 à sexta do mix de A A PC. Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para semear 160 microlitros de células por poço em uma placa de cultura tecidual de 96 poços com fundo em U. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por sete dias.

Alimente as células no quarto dia com 80 microlitros por poço de meio de cultura com fator de crescimento para linfócitos T. Recolha as células no sétimo dia e, em seguida, coloque o tubo contra o ímã para remover o A A PC antigo quando todas as microesferas aderirem à parede do frasco.

Colete e transfira as células para outro tubo cônico de 50 mililitros e conte o número de células. Determine a especificidade antigênica da APC AA por meio de coloração com tetrâmero, conforme o protocolo do fabricante. Incube novamente as células coletadas com nova APC AA nas mesmas condições para aumentar o número de células com especificidade antigênica.

Aqui está um resultado representativo de coloração com tetrâmero de CTL específicas para CMV geradas por A A PC após uma semana de cultivo. É mostrado aqui um resultado representativo de coloração intracelular de citocinas de CTL específicas para CMV geradas por A-A-P-C-C-M-V, cuja especificidade foi de 61% pela coloração com tetrâmero. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área de linfócitos T, como, por exemplo, como identificar as condições ideais de cultivo e os requisitos para a modulação funcional de linfócitos T.

O método simples forneceu insights sobre o tratamento de doenças virais. Ele também pode ser aplicado em outros campos, como o câncer.