Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

O objetivo geral deste procedimento é eletropurar implantes retinianos de camundongos com repórteres transcricionais fluorescentes e quantificar seus níveis de expressão. Isso é feito isolando primeiro o tecido retiniano de camundongos neonatais por meio de dissecção. A segunda etapa do procedimento é eletro a retina com construções repórteres de DNA fluorescente.

A terceira etapa do procedimento é cultivar as retinas eletroporadas como implantes por oito dias. A etapa final do procedimento é colher a explicação da retina e quantificar os níveis de expressão dos repórteres fluorescentes. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os níveis relativos de expressão de diferentes construtos repórteres promotores na retina de camundongos em desenvolvimento por meio de eletroporação x explan, seguida de análise quantitativa de dados.

Meu nome é Joe Corbo e sou membro do corpo docente do Departamento de Patologia e Imunologia da Escola de Medicina da Universidade de Washington em St.Louis. E hoje vamos apresentar um protocolo de vídeo demonstrando a técnica de eletroporação X explanation em retinas de camundongos recém-nascidos com o objetivo de quantificar a atividade de elementos reguladores CYS específicos de fotorreceptores e demonstrar que este protocolo será um estudante de pós-graduação do meu laboratório, Cindy Montana. Primeiro esterilize a câmara de eletroporação e todos os instrumentos com etanol a 70% em preparação para a coleta ocular.

Desinfete as luvas e a bancada com etanol e mantenha as condições estéreis durante todo o procedimento. Em seguida, em uma pipeta de capuz de cultura de tecidos, seis mililitros de meio de dissecção em uma placa de Petri estéril de 60 milímetros e três mililitros de meio em duas placas estéreis de 35 milímetros. De volta à bancada, desinfete a cabeça e o pescoço de um filhote de rato recém-nascido com 70% de etanol.

Depois de decapitar rapidamente a cabeça usando uma tesoura, transfira a cabeça para um prato estéril de 100 milímetros, corte o couro cabeludo com uma tesoura pequena para expor os olhos sob um microscópio de dissecação. Usando uma pinça curva, retire suavemente o olho da órbita e, em seguida, coloque-o em um prato de 35 milímetros contendo dissecação. Média. Continue a coletar os olhos de forma que haja três a quatro olhos por alíquota de DNA a ser eletroporada, mantendo os olhos e o meio de dissecção em temperatura ambiente até terminar.

Desinfete uma lâmina de barbear e o invólucro de uma pipeta de transferência de plástico estéril com 70% de etanol e, em seguida, use a lâmina de barbear para cortar a ponta da pipeta alto o suficiente para que um olho inteiro possa ser pipetado. Usando a pipeta alargada, transfira um olho da placa de 35 milímetros para a placa de 60 milímetros sob um microscópio de dissecação em alta potência. Use uma pinça fina para remover qualquer tecido, como músculos extraoculares e gordura da superfície do olho.

Em seguida, remova o nervo óptico apertando-o na base. Para isolar a retina, faça um pequeno orifício na esclera no limbo, a esclera e o epitélio pigmentado da retina parecem brilhantes em relação ao tecido da retina, que é Matt Gray. Insira um pino de ambos os pares de pinças no orifício e abra suavemente a esclera e o EPR.

Certifique-se de deixar a lente no lugar. Use a pipeta alargada para mover a retina dissecada para o segundo prato de 35 milímetros contendo o meio. Colete todas as retinas e armazene-as em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Até a eletroporação funcionar em uma capa de cultura de tecidos para cada DNA Eloqua a ser eletroporado, encha uma placa estéril de 35 milímetros com meio de dissecção e uma segunda placa com meio de cultura. Usando uma pipeta P 200, lave as câmaras na placa de eletroporação com esterilização uma XPB S3 vezes. Encha as câmaras com as alíquotas de DNA de 60 microlitros e encha as câmaras não utilizadas com 60 microlitros de um XPBS.

Conecte os eletrodos ao prato de eletroporação e insira as configurações apropriadas no eletro. Use uma pinça fina para agarrar as retinas pelo cristalino e transferi-las para as câmaras de eletroporação. Colocação de até quatro retinas em cada câmara.

Disponha as retinas de forma que a lente se encoste na barra de metal presa ao eletrodo positivo. Limpe o fórceps entre cada câmara para evitar a transferência de DNA de uma câmara para outra. Depois que todas as retinas estiverem alinhadas, pressione start no eletro.

Pequenas bolhas devem se formar na barra de metal presa ao eletrodo negativo. Desconecte os eletrodos e desligue o eletro usando uma pinça. Afaste suavemente as retinas das paredes da câmara.

Transfira as retinas das câmaras para os pratos de 35 milímetros contendo o meio de dissecação. Usando uma pipeta de transferência estéril, transfira as retinas do meio de dissecção para os pratos de 35 milímetros contendo o meio de cultura. Rotule os alvéolos de uma placa de cultura estéril de seis poços e encha cada poço com três mililitros de cultura. Média.

Use uma pinça estéril para flutuar em volta dos filtros watman nucleo sobre o meio em cada poço, com o lado brilhante dos filtros voltado para cima. Com a ajuda de um escopo de dissecação, transfira uma única retina para o filtro com a lente da pipeta de transferência estéril voltada para baixo. Se a retina pousar com o lado da lente para cima, puxe-a de volta para a pipeta e tente novamente.

Coloque no máximo quatro retinas em cada poço e mantenha-as em gotículas separadas. Uma vez que as retinas tenham sido colocadas nos poços, mova a placa de cultura para uma incubadora de cultura de tecidos de 37 graus Celsius e cresça pelo tempo desejado. Geralmente oito dias vistos Aqui está a eletroporação bem-sucedida resulta na expressão da construção do DNA em um quarto a um terço da superfície da retina.

Os níveis de fluorescência são quantificados comparando regiões uniformemente eletroporadas que expressam a construção CRE com regiões fora da retina e, em seguida, normalizando para controlar a expressão de GFP. Os fotorreceptores de bastonetes, em particular, são eficientemente transduzidos mostrados. Aqui estão os resultados de uma eletroporação na qual dois promotores específicos de bastonetes impulsionam a expressão de GFP e DS vermelho na camada nuclear externa.

Ao sobrepor os dois padrões de expressão com a coloração DPI mostrada aqui em azul, a expressão específica do fotorreceptor é aparente. Nenhuma expressão é observada na camada interclear ou na camada de células ganglionares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como dissecar eletro e cultura de explantes de retina de camundongos com o objetivo de quantificar a atividade dos elementos reguladores do cisto retiniano.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.