Name: Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar a atividade de elementos cis-reguladores na retina de camundongos usando eletroporação de explantes. Este método permite analisar a expressão de repórteres fluorescentes em fotorreceptores.

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Os autores gostariam de agradecer a Karen Lawrence por sua ajuda com a construção seção que descreve da câmara de eletroporação.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
<li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Genomic+regulatory+systems+%3A+development+and+evolution%22">Genomic regulatory systems : development and evolution</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22Genes+%26+signals%22">Genes & signals</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).</li>
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<li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
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<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li>
<li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li>
<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
<li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Eletroporação explante é um meio simples de quantificar cis-regulatórias atividade na retina do rato em desenvolvimento. Comparado com cis-regulatórias análise via transgenia mouse, eletroporação é muito mais barato, exigindo filhotes de rato recém-nascidos só, DNA, instrumentos de dissecação, e eletroporação / equipamentos de cultura de tecidos. É também muito menos tempo consumindo: um experimento requer apenas algumas horas de tempo de preparação, um período de cultura de cerca de oito dias e algumas horas no final do experimento para geração de imagens e análise de dados. Eletroporação explante também é superior à análise de cultura de células baseado em cis-regulatórias desde tecido da retina real é utilizado. A retina desenvolve bastante normalmente em explante cultura faz três distintas camadas celulares (camada nuclear externa, camada nuclear interna e camada de células ganglionares), apesar de fotorreceptores não formulam segmentos externos. Uma outra vantagem é que eletroporação explante é altamente reprodutível. As construções mesmo em retinas electroporated diferentes, mesmo em dias diferentes, geralmente resulta no mesmo nível de expressão relativa. Além disso, como os plasmídeos electroporated são pensados ​​para ser mantida episomally no núcleo e não são incorporados nos cromossomos, que parecem não estar sujeitos aos efeitos da integração mesmo site que atormentam cis-regulatórias análise realizada em camundongos transgênicos. Eletroporação explante tem várias limitações. Primeiro, apenas as células que ainda estão no ciclo celular pode ser eficientemente transduzidas por eletroporação 15. Em P0, varetas e outros mais tarde, nascido tipos de células da retina (células bipolares, células amácrinas, M ller glia) são as populações de células principais visados ​​por este método. Eletroporação de cones fotorreceptores por P0 eletroporação tem sido relatada 16, mas a eficiência parece ser baixa. Uma segunda limitação é que a cultura de explantes além de dois resultados semanas em malformação progressiva da retina e não é recomendada. Se quantificação promotor é necessário em intervalo de tempo final, no entanto, uma eletroporação in vivo 09 de maio será realizada, seguida de dissecção da retina no ponto no tempo desejado, flat-fixação da retina dissecados e quantificação conforme descrito na seção 9. Uma terceira limitação é que este ensaio é apenas moderadamente alto rendimento. Ao contrário dos ensaios de cultura de células-based que pode testar centenas de construções em um único experimento, a técnica descrita neste protocolo requer um mínimo de uma retina do rato por toda construir. Assim, apenas uma dúzia de construções podem ser razoavelmente electroporated em um dia. Uma ressalva adicionais com respeito à quantificação da atividade do promotor com a presente abordagem é que há um potencial para &quot;sangrar-through &#39;de fluorescência DsRed no canal GFP, particularmente quando se examina promotores muito forte. A razão para isto é que o espectro de emissão de DsRed parcialmente idêntica à do GFP. Para contornar esse problema, filtros de emissão otimizada deve ser usado que minimizam a sobreposição espectral entre DsRed e GFP. Quando tal otimizado conjuntos de filtros não estão disponíveis, outra possível solução seria a utilização de uma proteína fluorescente azul-deslocada (por exemplo, BFP ou PCP) em vez de GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Prato eletroporação, MICROSLIDE 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Ver protocolo seção 1 para modificações </td></tr><tr><td> 100% de borracha de silicone de cimento aquário </td><td> Perfecto Manufacturing </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rack de microtubo de plástico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Apenas a alça de rack será usado </td></tr><tr><td> Ferramenta Dremel </td><td></td><td></td><td> Para cortar a alça fora do rack tubo de plástico </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> Concentração 100X </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Para o estoque 1000X, ressuspender a 5mg/ml em HCl 5mM e filtro-esterilize </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 electroporator de onda quadrada </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtros Nuclepore </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0,2 Hm </td></tr><tr><td> Cultura de tecidos incubadora </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Lamínulas de vidro # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 milímetros de espessura </td></tr><tr><td> Microscópio composto fluorescente equipado com câmera </td><td></td><td></td><td> Câmera deve ser monocromática (por exemplo, ORCA-ER câmera Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / conjunto de filtros para DsRed microscópio composto </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Este conjunto de filtros bleedthrough minimiza entre o chanenels vermelho e verde </td></tr><tr><td> Software ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantificar a atividade de cis elements-regulação na retina do rato por eletroporação remoção

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Fatores de transcrição de genes dentro das redes celulares controlar o padrão espaço-temporal e os níveis de expressão de seus genes-alvo pela ligação a elementos cis-reguladores (CREs), de curta duração (~ 300-600 pb) trechos de DNA genômico, que pode mentir montante, a jusante, ou dentro os íntrons dos genes que controlam. CREs (ie, enhancers / promotores) tipicamente consistem de múltiplos agrupados sítios de ligação para ambos os ativadores e repressores transcripcional 1-3. Eles servem como integradores de lógica de entrada de transcrição dando uma saída unitária na forma de atividade do promotor espaço-temporalmente preciso e quantitativamente exata. A maioria dos estudos de mamíferos cis-regulação, até à data têm contado com transgênese mouse como um meio de doseamento a função realçador de CREs 4-5. Esta técnica é demorado, caro e, por conta dos efeitos local de inserção, em grande parte não-quantitativo. Por outro lado, ensaios quantitativos para a função CRE mamíferos têm sido desenvolvidos em sistemas de cultura de tecidos (por exemplo, dual ensaios luciferase), mas o in vivo relevância destes resultados é muitas vezes incerto. Eletroporação oferece uma excelente alternativa para transgenia mouse tradicional na medida em que permite tanto a avaliação espaço-temporal e quantitativa da cis-regulatórias atividade no tecido vivo em mamíferos. Esta técnica tem sido particularmente útil na análise de cis-regulação no sistema nervoso central, especialmente no córtex cerebral e da retina 6-8. Enquanto eletroporação do mouse na retina, tanto in vivo e ex vivo, foi desenvolvida e amplamente descrito por Matsuda e Cepko 6-7,9, desenvolvemos recentemente uma abordagem simples para quantificar a atividade dos fotorreceptores específicos CREs em electroporated rato retinas 10. Dado que a quantidade de DNA que é introduzido na retina por eletroporação pode variar de experimento para experimento, é necessário incluir um co-electroporated &quot;controle de carga&quot; em todos os experimentos. A este respeito, a técnica é muito semelhante ao ensaio de luciferase dupla utilizada para quantificar atividade do promotor em células em cultura. Quando se examina as fotorreceptoras atividade cis-regulatórias, eletroporação é geralmente realizado em ratos recém-nascidos (dia pós-natal 0, P0) que é o tempo de produção da haste de pico 11-12. Uma vez que os tipos de células da retina tornam-se pós-mitótico, eletroporação é muito menos eficiente. Dada a elevada taxa de nascimento haste em ratos recém-nascidos eo fato de que hastes constituem mais de 70% das células da retina de camundongos adultos, a maioria das células que estão em electroporated P0 são hastes. Por esta razão, os bastonetes são o tipo mais fácil de células da retina para estudar via eletroporação. A técnica aqui descrita é útil principalmente para quantificar a atividade de CREs fotorreceptoras.

Este protocolo descreve uma maneira simples e barata para quantificar a atividade de cis-regulatórias elementos (ie, enhancer / promotores) na vida retinas do mouse via eletroporação explante. Preparação de DNA, a dissecção da retina, eletroporação, a cultura de explantes de retina, e pós-fixação análise e quantificação são descritos.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Fatores de transcrição em redes gênicas celulares controlam o padrão espaciotemporal e os níveis de expressão de seus genes-alvo ao ligarem-se a ...

O objetivo geral deste procedimento é eletroporar implantes retinianos de camundongo com repórteres transcricionais fluorescentes e quantificar seus níveis de expressão. Isso é realizado primeiramente isolando o tecido retiniano de camundongo neonatal por meio de dissecação. O segundo passo do procedimento é eletroporar a retina com construtos de repórter de DNA fluorescente.O terceiro passo do procedimento é cultivar as retinas eletroporadas como implantes por oito dias. O passo final do procedimento é coletar o explante retiniano e quantificar os níveis de expressão dos marcadores fluorescentes. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os níveis relativos de expressão de diferentes construtos repórter de promotor na retina em desenvolvimento de camundongo por meio da eletroporação de x explantes, seguida de análise quantitativa de dados.Meu nome é Joe Corbo e sou membro do corpo docente do Departamento de Patologia e Imunologia da Escola de Medicina da Universidade de Washington em St. Louis. Hoje vamos apresentar um protocolo em vídeo demonstrando a técnica de eletroporação em explantes de retina de camundongos recém-nascidos, com o objetivo de quantificar a atividade de elementos reguladores cis específicos de fotorreceptores, e este protocolo será demonstrado por uma estudante de pós-graduação do meu laboratório, Cindy Montana. Primeiramente, esterilize a câmara de eletroporação e todos os instrumentos com etanol 70% em preparação para a coleta dos olhos.Desinfete as luvas e a superfície da bancada com etanol e mantenha condições estéreis durante todo o procedimento. Em seguida, em uma capela de cultura celular, pipete seis mililitros de meio de dissecção para uma placa de Petri estéril de 60 milímetros e três mililitros de meio para duas placas estéreis de 35 milímetros. De volta à bancada, desinfete a cabeça e o pescoço de um filhote de camundongo recém-nascido com etanol a 70%.Após decapitar rapidamente a cabeça com tesoura, transfira a cabeça para uma placa estéril de 100 milímetros, corte o couro cabeludo com uma tesoura pequena para expor os olhos sob um microscópio estereoscópico. Usando pinças curvas, retire suavemente o olho da órbita e, em seguida, coloque o olho em uma placa de 35 milímetros contendo Meio_de_Dissecação. Continue a coletar olhos de modo que haja três a quatro olhos por alíquota de DNA a ser eletroporada, mantendo os olhos e o meio de dissecação à temperatura ambiente até o término.Desinfete uma lâmina de barbear e a embalagem de uma pipeta de transferência plástica estéril com etanol 70%, e em seguida use a lâmina para cortar a ponta da pipeta em uma altura suficiente para que um olho inteiro possa ser pipetado. Usando a pipeta alargada, transfira um olho do disco de 35 milímetros para o disco de 60 milímetros sob um microscópio estereoscópico em alta potência. Utilize pinças finas para remover qualquer tecido, como músculos extraoculares e gordura, da superfície do olho.Em seguida, remova o nervo óptico pinçando-o na base. Para isolar a retina, faça um pequeno orifício na esclera na região do limbo, onde a esclera e o epitélio pigmentado da retina aparecem brilhantes em comparação com o tecido retiniano, que é cinza fosco. Insira uma ponta de cada par de pinças no orifício e rasgue suavemente a esclera e o EPR.Certifique-se de deixar a lente no lugar. Use a pipeta alargada para transferir a retina dissecada para o segundo recipiente de 35 milímetros contendo meio. Colete todas as retinas e armazene-as em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.Até a eletroporação, trabalhando em uma câmara de cultura de tecidos para cada DNA Eloqua a ser eletroporado, preencha um prato estéril de 35 milímetros com meio de dissecação e um segundo prato com meio de cultura. Usando uma pipeta P200, lave as câmaras no prato de eletroporação com 1× PBS estéril 3 vezes. Preencha as câmaras com alíquotas de DNA de 60 microlitros e preencha quaisquer câmaras não utilizadas com 60 microlitros de 1× PBS.Conecte os eletrodos ao recipiente de eletroporação e insira as configurações apropriadas no eletroporador. Use pinças finas para segurar as retinas pela lente e transferi-las para as câmaras de eletroporação. Coloque até quatro retinas em cada câmara.Posicione as retinas de modo que a lente encoste na barra metálica ligada ao eletrodo positivo. Limpe a pinça entre cada câmara para evitar contaminação cruzada de DNA de uma câmara para a outra. Após alinhar todas as retinas, pressione iniciar no eletroporador.Devem se formar bolhas minúsculas na barra metálica ligada ao eletrodo negativo. Desconecte os eletrodos e desligue o eletro com pinças. Mova suavemente as retinas para longe das paredes da câmara.Transfira as retinas das câmaras para as placas de 35 milímetros contendo meio de dissecação. Usando uma pipeta estéril de transferência, transfira as retinas do meio de dissecação para as placas de 35 milímetros contendo meio de cultura. Rotule os poços de uma placa de cultura estéril de seis poços e preencha cada poço com três mililitros de meio de cultura.Use pin&ccedil;as est&eacute;reis para colocar suavemente filtros circulares Watman Nucleo sobre o meio em cada po&ccedil;o, com o lado brilhante dos filtros voltado para cima. Com aux&iacute;lio de um microsc&oacute;pio estereosc&oacute;pico, transfira uma &uacute;nica retina para o filtro usando uma pipeta de transfer&ecirc;ncia com o lado da lente voltado para baixo. Se a retina cair com o lado da lente para cima, aspire-a novamente para dentro da pipeta e tente novamente.Coloque não mais do que quatro retinas em cada poço e mantenha-as em gotas separadas. Depois que as retinas forem posicionadas nos poços, transfira a placa de cultura para um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e cultive pelo tempo desejado. Normalmente, após oito dias, observa-se aqui que os resultados bem-sucedidos de eletroporação resultam na expressão do construto de DNA em um quarto a um terço da superfície retiniana.Os níveis de fluorescência são quantificados comparando regiões uniformemente eletroporadas que expressam o construto CRE com regiões fora da retina e, em seguida, normalizando em relação à expressão de GFP controle. Os fotorreceptores bastonetes, em particular, são eficientemente transduzidos, conforme mostrado. Abaixo estão os resultados de uma eletroporação na qual dois promotores específicos de bastonetes direcionam a expressão de GFP e DS red na camada nuclear externa.Ao sobrepor os dois padrões de expressão com a coloração de DPI mostrada aqui em azul, a expressão específica dos fotorreceptores torna-se evidente. Nenhuma expressão é observada na camada intercalar nem na camada de células ganglionares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar, eletrizar e cultivar explantes retinianos de camundongo com o objetivo de quantificar a atividade de elementos reguladores de cistos retinianos.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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