Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

O objetivo geral deste procedimento é manipular a função do gene durante o período pós-natal do desenvolvimento do cérebro. Isso é feito primeiro selecionando e preparando os vírus apropriados, carregando-os na seringa e preparando o equipamento de injeção. Em seguida, o vírus é injetado no cérebro de filhotes de camundongos recém-nascidos, e a etapa final é sacrificar os animais e obter imagens das regiões injetadas.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram marcação diferencial de células controle e knockout por meio de microscopia de imunofluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a forma como o período de desenvolvimento pós-natal é geneticamente regulado. Para injeção, uma solução de vírus adeno-associado disponível comercialmente pode ser usada em título completo, normalmente 10 elevado a 12, cópias do genoma por mililitro para manipular um grande número de células.

Se for desejado esparso ou rotulagem, comece com uma diluição de um a 10. Depois de descongelar o vírus no gelo, transfira imediatamente o volume de pré-diluição para um tubo de PCR estéril de 250 microlitros. Mantenha a diluição no gelo. Agora.

Prepare a bomba injetora selecionando uma seringa apropriada e conectando-a a uma agulha de carregamento. Em seguida, aspire suavemente a solução de vírus até que uma bolha de ar muito pequena seja vista na seringa e um corante de carregamento inerte possa ser usado para facilitar essa etapa. Agora prenda a seringa à bomba com um retentor.

Em seguida, coloque suavemente o tubo de conexão entre a seringa e o porta-agulhas. Certifique-se de que a agulha de injeção esteja em contato direto com o tubo conjuntivo dentro do porta-agulha. Agora, mova lentamente a solução através do tubo conjuntivo até que uma pequena gota de solução seja visível na ponta da agulha.

Prenda cuidadosamente o êmbolo próximo ao bloco empurrador com um suporte na bomba. Defina a taxa de injeção para oito microlitros por minuto e defina o volume de injeção para entre um e dois microlitros. Em seguida, ajuste a configuração do diâmetro da seringa da bomba para corresponder ao diâmetro da seringa que você está usando.

Por fim, para proteger os filhotes durante a fase de recuperação, ajuste a placa de aquecimento para 38 graus Celsius e cubra-a com uma toalha de papel. Usando um protocolo aprovado pela IACUC, prepare filhotes de camundongos P zero ou P um para injeção, submetendo-os a anestesia fria. Umedeça algumas toalhas de papel com água e coloque-as no gelo.

Em seguida, coloque quatro ou cinco filhotes na toalha de papel bem separados. Dobre as toalhas de papel sobre os filhotes, coloque delicadamente uma pequena quantidade de gelo picado em cima das toalhas de papel e incube os filhotes por cerca de cinco minutos. Os filhotes podem ser mantidos com segurança no gelo por até 15 minutos e ainda ter uma boa recuperação.

Agora posicione um filhote anestesiado em um bloco de montagem para melhor acesso ao local da injeção. O córtex, por exemplo, é mais facilmente acessado deitando o animal de barriga para baixo. O filhote pode ser preso no lugar usando um curativo, estabilizar manualmente a cabeça do filhote e puxar a pele com força para evitar que ela se mova.

Em seguida, navegue pelos pontos de referência anatômicos do crânio, como a sutura lambda, e selecione um ponto de injeção reproduzível com a outra mão, insira suavemente a agulha no crânio. Não empurre com força se a agulha não penetrar facilmente no crânio. Em vez disso, reposicione a agulha e tente novamente com cuidado.

A profundidade da injeção varia ligeiramente entre animais individuais e cepas para o córtex, uma profundidade de meio a um milímetro geralmente funciona. Agora, injete a solução de vírus fazendo com que um colega ative a bomba para minimizar os movimentos das mãos. Idealmente, um pedal poderia ser usado para iniciar a bomba após a injeção.

Mantenha a agulha no lugar por alguns segundos e, em seguida, mantenha a cabeça do filhote imóvel suavemente. Deslize a agulha para fora. Agora, deixe o filhote se recuperar por cinco a 10 minutos na placa quente coberta.

Durante esse tempo, continue injetando outros filhotes. Quando todos os filhotes recuperarem a cor rosa e estiverem se movendo, esfregue-os suavemente com uma parte da roupa de cama de casa. Só então eles podem ser devolvidos à mãe.

Caso contrário, eles poderiam ser tratados como filhotes desconhecidos, que a mãe provavelmente mataria depois que os filhotes fossem devolvidos à mãe. Limpe a configuração da injeção carregando totalmente a seringa com acetona ou etanol a 70%. Se componentes sensíveis à acetona, como sano, acurate, adesivos, estiverem em uso, lave a solução através da configuração de injeção várias vezes usando solução nova a cada vez.

Isso removerá qualquer solução de vírus restante e precipitará que os solventes evaporarão. Depois de lavar a configuração, desinfete a área de trabalho do alvejante para deixá-lo pronto para o próximo experimentador. Mentor. A técnica bem-sucedida produz uma infecção neuronal robusta no local da injeção.

Injeções em regiões específicas, como o córtex e o colículo superior, normalmente geram infecções locais com disseminação mínima para regiões adjacentes. O uso de uma solução de vírus de alto título torna a infecção de áreas adjacentes, como o hipocampo, mais provável de injeção com uma solução de vírus de baixo título. Resulta em infecção esparsa normalmente perto do local da injeção, como a injeção cerebelar na linha média, o número de células infectadas deve se correlacionar com um título da solução viral injetada.

Por exemplo, injetar uma mistura de soluções de alto título de dois vírus R AAV oito expressando diferentes proteínas fluorescentes no cerebelo, infecta muitas células kinji que são marcadas diferencialmente. Por outro lado, injetar uma solução de vírus de baixo título pode resultar em infecção esparsa para ajudar na visualização de células individuais. Os neurônios marcados com fluorescência podem ser observados diretamente no tecido vivo recém-cortado ou podem ser submetidos a imunocoloração.

Isso aumenta os sinais fluorescentes endógenos para posterior aquisição de imagens por microscopia fluorescente de campo amplo ou confocal. Por fim, o RAAV oito é capaz de infectar uma variedade de tipos de neurônios no córtex com forte marcação de processos finos Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 30 minutos se for executada corretamente.