Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo

Um dos desafios de estudar o desenvolvimento em neurociência é capturar morfologias dendríticas e axonais em um único nível de célula in vivo. No sistema olfatório, os neurônios sensoriais olfatórios estendem seus axônios do epitélio olfatório no nariz até o bulbo olfatório no cérebro. À medida que vários neurônios sensoriais olfativos se projetam em direção ao bulbo olfatório, eles se transformam em feixes.

Isso complica o estudo das trajetórias individuais dos axônios e suas morfologias terminais. Desenvolvemos um método para visualizar neurônios sensoriais olfativos únicos in vivo por micro injeção de uma construção GFP. Carregando lentivírus.

A transdução bem-sucedida com lentivírus ilumina todo o comprimento do axônio sensorial olfatório, incluindo o mandril terminal. Além de visualizar neurônios sensoriais olfativos únicos, esse método nos permite manipular a expressão gênica de um determinado gene de interesse para estudar sua função em um contexto in vivo. Este procedimento de lentivírus é de nível de biossegurança dois e precisa ser realizado em uma capela de fluxo laminar.

Para manter um ambiente estéril, borrife tudo o que estiver inserido no capô com etanol a 70%, prepare e pré-aqueça um colchão d'água de 37 graus por pelo menos 20 minutos. Antes da injeção. Feche um saco plástico de armazenamento até a metade com água e coloque-o em uma incubadora de blocos de aquecimento vazia.

Isso permitirá que os camundongos se recuperem após a injeção. Encha um recipiente de resíduos de risco biológico com alvejante a 10% para descontaminar todo o material exposto ao vírus. A partir deste procedimento, prepare um pequeno prato aberto de etanol a 70% e um segundo prato com água destilada estéril.

Em uma capela de fluxo laminar, usaremos uma seringa Hamilton com capacidade de cinco microlitros com uma agulha de calibre 33. Este modelo específico permite ajustar a resistência do êmbolo girando um botão de tensão localizado na parte superior da câmara do êmbolo. Esse recurso fornece controle de volume de microinjeção para esterilizar a câmara da agulha e da seringa.

Aspire e ejete repetidamente o etanol do prato várias vezes. Enxágue o cartucho da seringa aspirando e ejetando água estéril várias vezes. Coloque a seringa de lado com segurança na tampa de fluxo.

Disponha lenços umedecidos com álcool perto da estação de injeção. Prepare um estágio de injeção que forneça uma superfície elevada que facilite o posicionamento do mouse. Pode-se usar um prato de cultura invertido de 10 centímetros coberto com lenços umedecidos.

Filhotes de camundongos podem ser anestesiados por hipotermia até a idade de desmame. Corte um dedo de uma luva de borracha e coloque o filhote de rato no corte do dedo. Em seguida, coloque no gelo por cinco minutos.

A luva evitará queimaduras na pele que ocorreriam devido ao contato direto da pele com o teste de gelo para anestesia completa, beliscando a parte traseira e as quatro patas do filhote para garantir que o animal não responda. Agora estamos prontos para a microinjeção de lentivírus. Estaremos demonstrando com um filhote neonatal.

Se uma idade mais avançada de camundongo for usada, deve-se substituir a agulha de calibre 33 por uma agulha de calibre mais grosso para penetrar na superfície do crânio. Esterilize a superfície do nariz do mouse limpando-a com uma compressa embebida em álcool. Remova os estoques de lentivírus do freezer e descongele no gelo.

Nós mesmos produzimos lentivírus em laboratório usando métodos estabelecidos. Ao desenvolver este método, descobrimos que um título viral mínimo de 10 elevado à nona unidade infecciosa por mil é necessário para uma boa taxa de transdução. Aspire dois microlitros de solução estoque de lentivírus para a seringa Hamilton esterilizada.

Coloque o filhote de camundongo em cima do estágio de injeção. Segure a pele no topo da cabeça nas orelhas e puxe suavemente para trás. Equipamos nossa coifa de fluxo com um escopo de dissecação.

Para direcionar com precisão as microinjeções, pesquise na superfície dorsal do crânio no prosencéfalo um contorno do bulbo olfatório. Nossos alvos de microinjeção cercam o bulbo olfatório, mas não devem incluir o bulbo em si. Damos quatro injeções no epitélio olfatório de cada filhote.

Essas posições representadas com pontos azuis exigem que a agulha seja inserida em um ângulo direcionado medialmente. As duas injeções adicionais representadas com pontos verdes são escalonadas, mais medialmente e anterior ao bulbo olfatório. Essas injeções podem ser inclinadas coddly.

As sugestões dos ângulos da agulha são feitas levando em consideração o posicionamento ventral do epitélio olfatório, que está situado principalmente abaixo do bulbo olfatório. O acesso perpendicular é, portanto, restrito. Insira a agulha na parte superior da cavidade nasal cerca de três milímetros abaixo da superfície da pele.

Para alcançar o epitélio olfatório. Uma mão treinada deve sentir a queda na resistência quando o espaço luminal da cavidade nasal for atingido. Esta área deve ser evitada.

Micro injetar 0,5 microlitros de solução estoque de vírus por posição. Novamente, escolhendo dois locais de cada lado, esquerdo e direito, quatro injeções no total de 0,5 microlitros. Cada um por camundongo significa dois microlitros de vírus necessários por camundongo em uma única sessão de injeção.

Novamente, tome cuidado para não injetar o bulbo olfatório em qualquer solução residual de vírus ou sangue que possa escapar do local da injeção ou das aberturas das narinas. Usando um lenço de etanol, descarte os lenços no recipiente branqueado líquido diluído, coloque imediatamente o camundongo injetado na incubadora do colchão d'água para recuperação. Descontamine a seringa da agulha repetindo o procedimento de esterilização realizado durante a preparação Os camundongos injetados podem ser devolvidos à gaiola 30 minutos após a recuperação na incubadora do leito d'água.

Toda essa microinjeção pode ser repetida novamente em quatro horas. Se você quiser aumentar o número de neurônios sensoriais olfativos que serão infectados, os neurônios sensoriais olfativos infectados podem ser visualizados em todo o comprimento da célula em apenas três dias. Os animais sacrificados e perfundidos para observação no momento desejado.

Usando métodos padrão Para visualizar as trajetórias dos neurônios sensoriais olfatórios de célula única transduzidos e os terminais axônicos, dissecamos e seccionamos o bulbo olfatório coronal com uma espessura de 60 mícrons. A seção conterá, portanto, todas as camadas celulares do bulbo olfatório, incluindo feixes de axônios de neurônios sensoriais olfatórios e terminais de axônios, que fazem sinapses em estruturas glomerulares ligadas à superfície do bulbo em preparação para imuno-histoquímica flutuante. Seções seriadas do bulbo olfatório são feitas e varridas coletivamente para uma placa de cultura de 10 centímetros com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato.

Transfira as seções flutuantes para um frasco cônico de 50 mililitros. Assim que as seções se acomodarem no fundo do frasco, aspire a solução salina tamponada com fosfato. Tome cuidado para não aspirar.

Suas seções são reabastecidas com 10 mililitros de tampão fresco para lavar qualquer fixador residual ou material de incorporação. Pipete imediatamente esta ressuspensão em um frasco cônico de 15 mililitros, certificando-se de capturar todas as seções flutuantes, aspirar a solução de enxágue e perfurar as seções com uma solução de 0,3% Triton X 100 em solução salina tampão fosfato em uma plataforma basculante por 10 minutos. À temperatura ambiente, você pode então prosseguir com um protocolo de imunocoloração padrão no mesmo frasco cônico, repetindo as etapas de vácuo e balancim conforme necessário para este tamanho de recipiente, reter um volume de 10 mililitros para as etapas de coloração e enxágue.

Aqui está uma lista de anticorpos que usamos para cos corar neurônios sensoriais olfativos transduzidos positivamente e a população geral de neurônios sensoriais olfativos. Para uma penetração completa de anticorpos nas seções do bulbo de 60 mícrons, recomenda-se incubar durante a noite a quatro graus Celsius. A profundidade de lavagem também não deve ser inferior a 20 minutos cada.

Espalhe suavemente cada seção em uma lâmina de vidro com um pincel, monte cada lâmina com flora Mount G suplementada com solução de mancha de cromatina. Faça esforços para eliminar todas as bolhas do meio de montagem. Monte suas seções em linhas para simplificar a etapa de triagem subsequente.

Escaneie essas camadas em suas seções de bulbo de coloração imunológica para as fibras e terminais do axônio positivo para GFP. Usando um microscópio fluorescente, os terminais nervosos infectados positivamente podem ser visualizados por microscopia confocal. É útil calibrar o plano focal em sua área de interesse usando o DPI e os canais de proteína do marcador olfatório.

Esses resultados mostram uma única fibra de axônio do neurônio sensor olfatório e terminal do axônio dentro do glomérulo, que é CO com proteína marcadora olfatória em vermelho e vlu dois em corpos celulares de neurônios sensores olfatórios infectados em cinza e seu botão dendrítico também pode ser visualizado dentro do epitélio olfatório se esse tecido foi incluído nas etapas de dissecção e imunocoloração. Olá, minha projeção confocal nos fornece uma morfologia muito detalhada de um único caminho de extensão axonal do neurônio sensorial olfativo e mandril terminal. Pode-se ver o engate da fibra axonal de volta ao seu alvo glomerular, bem como os detalhes de seu padrão de ramificação dentro da neuropílula glomerular.

O método de microinjeção lentiviral permite a visualização do axônio de célula única, morfologias de neurônios sensoriais olfativos e permite estudos que manipulam a expressão gênica, a transdução de lentivírus resulta em integração genômica estável de construtos. O lentivírus não infecta sinapticamente as células vizinhas. A visualização pode ser obtida em apenas três dias e foi confirmada para durar pelo menos três meses e provavelmente persiste por períodos mais longos.

Os neurônios sensoriais olfativos não são prontamente infectados pela infusão nasal de solução de lentivírus. Portanto, a microinjeção através da superfície é necessária neste procedimento. Então esse é o nosso procedimento de microinjeção de lentivírus.

Espero que você tenha achado todas essas informações úteis para alcançar morfologias de células únicas de sua própria caça feliz.