Name: Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprenda a manipulação genética e visualização de neurônios sensoriais olfatórios in vivo usando lentivírus. Este método permite estudar trajetórias axonais individuais e arborizações terminais no sistema olfatório.

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Este estudo é suportado pelo NIH e DC052256 DC006015 e NSF 0324769 para QG e T32-DC008072 a BS.

1. Preparação Este procedimento é de biossegurança nível 2, portanto, todas as seguintes preparações são feitas em uma cobertura de risco biológico, onde o procedimento de microinjeção é realizada. <ol><li> Preparar e pré-aquecimento a 37 ° C waterbed: Encha um saco de armazenamento de plástico com água - selo e fixado em um bloco de aquecimento esvaziado incubadora. Isso permitirá que os ratos se recuperar após a injecção. </li><li> Encher um recipiente de resíduos de risco biológico com lixívia a 10% para um volume adequado para imersão de todos os resíduos desse procedimento. </li><li> Prepare um pequeno prato aberto de etanol 70% e um segundo prato com ddH2O esterilizado e coloque no gabinete de segurança biológica. </li><li> Esterilizar uma seringa Hamilton 5μL capacidade com uma agulha de 33 gauge por pulverização para baixo do corpo e da agulha com álcool 70% com o êmbolo puxado para fora todo o caminho. Repetidamente aspirado de etanol a partir do prato e ejetá-lo todo o caminho, pelo menos, 5 vezes. </li><li> Lave o cartucho seringa, aspirando e expulsando água estéril, pelo menos, 5 vezes. Lugar seringa com segurança de lado na capa cultura e deixe-a secar. </li><li> Remover ações virais de -80 ° C de armazenamento freezer e colocar no gelo para permitir o descongelamento. Microinjeção requer 2μL de estoque de vírus por mouse em um título de 10 9 unidades infecciosas / mL. Lentivírus podem ser obtidas de fontes comerciais ou produzidos no laboratório de acordo com o protocolo estabelecido (Lois et al., 2002). </li><li> Prepare uma etapa de injeção que fornece uma área elevada acima da superfície do capô - pode usar uma placa de cultura 10 centímetros coberto com uma folha de Kimwipe. </li><li> Organizar toalhetes com álcool, perto da estação de injeção. </li></ol> 2. Microinjeção de partículas lentiviral no epitélio olfativo Todos os procedimentos com animais realizados neste método são feitas de acordo com IACUC diretrizes aprovadas. O Mus musculus cepa C57BL/6J é o modelo animal usado em todos os experimentos demonstraram aqui. <ol><li> Anestesiar os filhotes de rato por hipotermia, tendo um rato filhote de cachorro (P0-P3) fora da gaiola e colocar o filhote em uma luva de cut-aberto no gelo por 5 minutos. </li><li> Enquanto espera para o filhote de cachorro para ser totalmente anestesiado, 2μL aspirado de estoque viral dentro da seringa Hamilton esterilizados. </li><li> Posicione o mouse em cima do filhote o estágio de injeção. Puxe a pele longe do topo da cabeça ao ouvido, em direção ao topo do pescoço. Este deve fornecer uma superfície da pele ensinou sobre a cavidade nasal e vai facilitar a injeção. </li><li> Inserir a agulha através da parte superior da cavidade nasal cerca de 3 mm abaixo da superfície da pele para atingir o epitélio olfativo. Microinject 0.5μL de solução de vírus por um tiro, a escolha de dois locais de cada lado, esquerdo e direito (quatro injeções total por mouse = 2μL de vírus necessário). Os locais de injecção devem ser escalonados para além um do outro. Para a segmentação de locais de injecção adequada, pesquisa a superfície dorsal do crânio para o contorno do bulbo olfatório. Essa linha é pouco visível ao nascimento através da pele semi-translúcidas e crânio. Para fazer com que duas injeções por lado, um objetivo a injeção apenas um esboço rostral do bulbo em um eixo medial. Faça a inserção segunda lateral para o contorno do bulbo, mas certifique-se o ângulo de injeção medialmente de modo que você pode atingir o epitélio olfativo que reside ventralmente debaixo da lâmpada. Evitar penetrar no bulbo olfatório! </li><li> Secar qualquer solução de vírus residual ou de sangue que pode escapar do local da injeção ou aberturas narina usar uma Kimwipe. Imediatamente dispor de Kimwipes no recipiente de líquido diluído bleach biohazard. </li><li> Posicione o mouse injetado para a incubadora waterbed. </li><li> Repita os passos 1-4 para todos os ratos para ser injetado, lembrando que você vai precisar de cerca 2μL de estoque de vírus por mouse. </li><li> Vamos recuperar os ratos na incubadora waterbed por 30 minutos antes de devolvê-los nas suas gaiolas originais de nidificação. </li><li> Dispor de estágio microinjeção, wipes saneantes e quaisquer produtos de papel extra de limpeza na alienação alvejante biohazard. </li><li> Limpe a seringa Hamilton por aspiração repetida e ejeção de etanol e água, em seguida, como foi feito nas etapas de preparação. Retirar a seringa para secar. </li><li> Para a eficiência máxima de transdução de repetir esse procedimento novamente em 4 horas. ORS infectados pode ser visualizado em todo o comprimento da célula em apenas três dias. </li></ol> 3. Imuno-histoquímica de flutuar seções bulbo olfatório <ol><li> Sacrificar o rato injetado no ponto de tempo desejado e fixar o tecido de perfusão com paraformaldeído a 4%. Dissecar o OB. Incubar em paraformaldeído durante a noite e, em seguida, sacarose 30% em PBS durante a noite. Incorporar em outubro meio de incorporação em gelo seco. </li><li> Cortes coronais OB são obtidos em 60μm de espessura usando um criostato. Varrer seções lâmpada em uma placa de cultura com 10 centímetros de 5ml 1x PBS (pH 7,4). Seções devem ser mantidos flutuando em PBS para permitir a outubro dissolve. Transferência de seções flutuantes e PBS em um frasco de 50 ml cônico. </li><li> Permitir seções para se depositar no fundo do frasco. Vácuo off PBS sem sugando todas as seções. Enxágüe secções de tecido com PBS 20mL. Repita os passos resolver e aspiração. Ressuspender tecido com 10 ml de PBS e seções de transferência flutuante para um frasco de 15mL cônico para imunocoloração. Uma vez que as secções de tecido se instalaram, vácuo off PBS sobrenadante sem perturbar o tecido. Ressuspender seções com 0,3% Triton X-100 em 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) permitindo que o detergente para perfurar as membranas celulares. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Vácuo fora o sobrenadante e repetir a incubação com PBS-Tx duas vezes. </li><li> Incubar cortes de tecido, em 10ml de solução de bloqueio (soro de cavalo de 5% em PBS-Tx) por duas horas à temperatura ambiente. </li><li> Solução de lavagem de bloqueio, pelo menos, duas vezes com PBS-Tx de 15 minutos cada em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 2 mL de uma solução de anticorpo primário em PBS-Tx. Ver Reagentes e Equipamentos para a seção de anticorpos utilizados neste experimento. </li><li> Substituir lavagem PBS-Tx segundo bloqueio com solução de anticorpo primário. Incubar em uma plataforma de balanço devagar (~ 30rpm) a 4 ° C por 24-48 horas para assegurar uma penetração completa nas seções 60μm flutuante. </li><li> Após a incubação, a solução anticorpo primário pode ser recuperada com cuidado, utilizando uma pipeta e armazenados a 4 ° C para a reutilização de até duas vezes mais dentro de duas semanas sem qualquer perda significativa de intensidade da coloração. </li><li> Lavar seções três vezes em PBS-Tx de 20 minutos cada em temperatura ambiente com rotação suave (~ 30rpm). </li><li> Prepare 2 ml de diluição do anticorpo secundário em PBS-Tx. Vácuo fora da última lavagem, e adicione a solução de anticorpo secundário para as seções do tecido. Envolva a parte externa do frasco de coloração em papel alumínio para bloquear a luz, o que pode causar fotobranqueamento fluoróforo. Lugar envolto frasco em uma plataforma de balanço devagar e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Eliminar a solução anticorpo secundário por aspiração de distância. Lavar seções uma vez com PBS-Tx de 20 minutos cada em temperatura ambiente. Enxágüe duas vezes adicionais com PBS (pH 7,4) por 20 minutos cada em temperatura ambiente. Monte as secções de tecido manchado em lâminas de vidro usando Fluoromount G. </li><li> Tela através de cortes corados por axônios OSN positivamente infectados e termini axônio com um microscópio de fluorescência. </li><li> Para construir uma visão tridimensional de um rotulados OSN axônio e arbor terminal, fazer uma série de secções ópticas através da profundidade 60μm da fatia de tecido-alvo OB (ao longo do eixo z), utilizando microscopia confocal. </li><li> Esta pilha de Z-seção de imagens podem posteriormente ser projetada em conjunto para reconstruir uma perspectiva de 360 ​​° de rotação de um único axônio rotulados OSN, incluindo terminal detalhes arbor na sua totalidade. Qualquer um único ângulo de rotação podem ser capturados e exportados como um arquivo de imagem (ou seja, JPG, TIFF) para a apresentação formato 2D. </li></ol> 4. Resultados representante Com os métodos descritos aqui, pode converter neurônios sensoriais olfativos por lentivírus in vivo. Temos até o momento visualizado ORS infectados com GFP e repórteres mCherry fluorescentes, bem com uma tag-myc proteína de fusão através de imunocitoquímica. Esta técnica oferece uma abundância de ORS infectados. Ainda assim, transdução ocorre esporadicamente o suficiente para fornecer ORS etiquetadas individualmente, permitindo assim a análise da morfologia única célula. Axônios e os terminais do axônio são gravadas dentro de seções de tecido OB no meio seu ambiente nativo através de microscopia confocal (Figura 1). Toda a OSN axônio terminal arbor geralmente pode ser cativado dentro de uma seção de 40 50 ìm óptica. Alta ampliação dos terminais do axônio infectados OSN permite a análise detalhada da morfologia arbor axonal na camada glomerular. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figura 1. Trajetória de um único neurônio sensorial olfativa axônio e seu terminal arbor. A) A seção coronal do bulbo olfativo de um rato P7 mostrando a camada de nervos olfativos (ONL) histoquímica para OMP (vermelho) e da camada glomerular (GL) imunocoradas com ambas as OMP e Vglut2 (cinza). Um axônio único neurônio sensorial olfativa expressando GFP (verde) viaja dentro do ONL e penetra na estrutura glomerular. B) O axônio terminal morfologia arbor dentro do glomérulo claramente evidenciado pela expressão GFP. Vglut2 co coloração cinza-in ilumina a área total glomular dentro do qual a GFP positivas axônio elabora um aborto terminal. C) Lentivirus ORS infectados expressando GFP (verde) no OE. O cytostructure do epitélio olfativo é mostrado com coloração DAPI (azul). Expressão GFP permite a visualização de corpos celulares OSN e seus processos celulares no OE. D) Um axônio OSN e sua morfologia terminal com Rap1GAP2 expressão knock-down por shRNA. Lentivírus carregando um cassete de expressão dupla com Rap1GAP2 shRNA sob o promotor U6 mouse e GFP sob umPromotor CMV foram aplicados ao OE. Infectados terminais do axônio olfativa exibiu uma mais simplificada terminal arbor quando comparada com a do controle apenas GFP. Bar = 20Hm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Este protocolo é bio-segurança compatível com o nível 2. Todas as medidas de contenção do espaço de trabalho adequadas, proteção pessoal, e viral resíduos foram estabelecidas em conformidade. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes IACUC.

Microinjeção de resultados lentivírus de transferência permanente de construções de gene em OSN DNA genômico. Essa abordagem nos permite realizar manipulações de curto prazo ou longo prazo de genes candidatos via superexpressão ou mediada shRNA knock-down. Além disso, podemos fluorescente ORS rótulo único em uma linha de rato transgênico existentes para observar co-localização das populações receptor de odorante. Microinjeção é necessário para a transdução lentiviral de ORS. Nós tentamos rubor suspensão lentivírus na ca...

Microinjeção: ratos recém-nascidos receberam microinjeções usando uma seringa 5μL Hamilton (Hamilton # 7647-01), equipada com uma agulha de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Reagentes imunocitoquímica: anticorpos primários: coelho GFP anticorpo policlonal (Molecular Probes # A-6455), de anticorpos policlonais contra OMP de frango (sob encomenda) (Chen et al, 2005.), Guiné porco de anticorpos policlonais contra VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorpos secundários: Cy2 conjugada burro anti-coelho (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-burro conjugado anti-galinha (Jackson Immunolab # 703-165-155) e Cy5-cabra conjugado anti-cobaia (Jackson Immunolab # 106-175-008). Os cortes foram montados em lâminas de vidro com Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) com solução de 50ng/mL cromatina DAPI mancha. Confocal Imaging: Z-stack imagens foram tiradas com uma Olympus Flouview FV1000 microscópio confocal e imagens coletadas e processadas em projeções 3D usando Olympus FV10-ASW aquisição 2,01 confocal e software de análise.

lentivírus mediada manipulação genética e visualização de olfactory neurônios sensoriais in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Desenvolvimento de um circuito precisa olfativa depende de projeção precisa de olfactory neurônio sensorial (OSN) axônios a seus alvos synaptic no bulbo olfativo (OB). Os mecanismos moleculares da OSN crescimento do axônio e segmentação não são bem compreendidos. Expressão do gene manipulação e posterior visualização dos axônios OSN solteiras e seus terminais morfologia arbor até agora têm sido um desafio. Para estudar a função dos genes ao nível única célula dentro de um prazo especificado, que desenvolveu uma técnica baseada lentiviral para manipular a expressão do gene em ORS in vivo. Partículas Lentivirus são entregues ORS por microinjeção no epitélio olfativo (OE). Cassetes de expressão são, então, permanentemente integrado no genoma da ORS transduzidas. Expressão da proteína fluorescente verde identifica ORS infectadas e delineia sua morfologia inteiro, incluindo o terminal axonal arbor. Devido ao tempo de resposta curto entre microinjeção e detecção de repórter, estudos da função do gene pode ser focado dentro de um período muito estreito de desenvolvimento. Com este método, nós temos detectado expressão GFP dentro de apenas três dias e até três meses após a injeção. Temos conseguido tanto a expressão mais e shRNA mediada knock-down por microinjeção lentiviral. Este método fornece morfologias detalhada dos corpos celulares e axônios OSN no nível da célula única in vivo e, portanto, permite a caracterização da função de genes candidatos durante o desenvolvimento olfativo.

Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização terminal<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

O desenvolvimento de um circuito olfativo preciso depende da projeção acurada dos axônios dos neurônios sensoriais olfativos (NSO) para os seus alvos sinápticos no...

Um dos desafios do estudo do desenvolvimento na neurociência é capturar as morfologias dendríticas e axônicas em nível de célula única in vivo. No sistema olfativo, os neurônios sensoriais olfativos estendem seus axônios do epitélio olfativo no nariz até o bulbo olfativo no cérebro. À medida que múltiplos neurônios sensoriais olfativos projetam-se em direção ao bulbo olfativo, eles se agrupam em feixes.Isso complica o estudo das trajetórias individuais dos axônios e suas morfologias terminais. Desenvolvemos um método para visualizar neurônios sensoriais olfativos individuais in vivo por meio da microinjeção de um construto GFP associado a lentivírus.A transdução bem-sucedida com lentivírus ilumina todo o comprimento do axônio sensorial olfativo, incluindo a arborização terminal. Além de permitir a visualização de neurônios sensoriais olfativos individuais, este método nos permite manipular a expressão gênica de um gene de interesse específico para estudar sua função em um contexto in vivo. Este procedimento com lentivírus requer nível de biossegurança dois e deve ser realizado em uma cabine de fluxo laminar.Para manter um ambiente estéril, pulverize com etanol 70% tudo o que for inserido na cabine, prepare e pré-aqueça uma cama d'água a 37 °C por pelo menos 20 minutos antes da injeção. Sobre um bloco de aquecimento incubador vazio, coloque um saco plástico de armazenamento selado, preenchido pela metade com água.Isso permitirá que os camundongos se recuperem após a injeção. Encha um recipiente de resíduos biológicos com água sanitária a 10% para descontaminar todos os materiais expostos ao vírus. A partir deste procedimento, prepare um pequeno recipiente aberto com etanol a 70% e um segundo recipiente com água destilada estéril.Em uma cabine de fluxo laminar, utilizaremos uma seringa Hamilton com capacidade de cinco microlitros e agulha de calibre 33. Esse modelo específico permite ajustar a resistência do êmbolo girando um dial de tensão localizado na parte superior da câmara do êmbolo. Esse recurso proporciona controle do volume de microinjeção e esteriliza a agulha e a câmara da seringa.Aspire e eja etanol repetidamente do recipiente várias vezes. Enxágue a cartela da seringa aspirando e ejetando água estéril várias vezes. Coloque a seringa em local seguro dentro da cabine de fluxo laminar.Organize lenços umedecidos com álcool próximo à estação de injeção. Prepare uma plataforma de injeção que forneça uma superfície elevada, facilitando o posicionamento do camundongo. Pode-se usar uma placa de cultura de 10 centímetros invertida, coberta com lenços de papel Kim.Filhotes de camundongo podem ser anestesiados por hipotermia até a idade de desmame. Corte um dedo de uma luva de borracha e coloque o filhote dentro do corte no formato de dedo. Em seguida, coloque sobre gelo por cinco minutos.A luva evitará queimaduras na pele que ocorreriam pelo contato direto da pele com o gelo. Teste a anestesia completa beliscando as patas traseiras e dianteiras do filhote para garantir que o animal não responda. Agora estamos prontos para a microinjeção de lentivírus. Iremos demonstrar o procedimento com um filhote neonatal.Se for utilizada uma idade mais avançada do camundongo, deve-se substituir a agulha de 33 graus por uma agulha de maior calibre para penetrar a superfície do crânio. Esterilize a superfície nasal do camundongo limpando-a com um disco de álcool. Retire os estoques de lentivírus do congelador e descongele em gelo.Produzimos lentivírus em nosso laboratório utilizando métodos estabelecidos. Ao desenvolver este método, descobrimos que uma titulação viral mínima de 10 elevado à nona unidades infecciosas por mililitro é necessária para uma boa taxa de transdução. Aspire dois microlitros da solução estoque de lentivírus para a seringa esterilizada de Hamilton.Coloque o filhote de camundongo sobre a plataforma de injeção. Segure a pele no topo da cabeça pelas orelhas e puxe suavemente para trás. Equipamos nosso fluxo laminar com um microscópio estereoscópico.Para direcionar com precisão as microinjeções, examine a superfície dorsal do crânio na região do prosencéfalo em busca do contorno do bulbo olfatório. Nossos alvos de microinjeção envolvem de perto o bulbo olfatório, mas não devem incluir o próprio bulbo. Aplicamos quatro injeções no epitélio olfatório de cada filhote.Essas posições representadas por pontos azuis requerem que a agulha seja inserida em um ângulo direcionado medialmente. As duas injeções adicionais representadas por pontos verdes são deslocadas, mais medial e anterior ao bulbo olfatório. Essas injeções podem ser feitas com ângulo oblíquo.As sugestões de ângulos da agulha são feitas levando em consideração o posicionamento ventral do epitélio olfatório, que está principalmente situado abaixo do bulbo olfatório. Assim, o acesso perpendicular é restrito. Insira a agulha através do topo da cavidade nasal, cerca de três milímetros abaixo da superfície da pele.Para alcançar o epitélio olfativo. Uma mão treinada deve sentir a diminuição da resistência ao atingir o espaço luminar da cavidade nasal. Esta área deve ser evitada.Microinjetar 0,5 microlitros de solução estoque do vírus por posição. Novamente, escolhendo dois sítios por lado, tanto esquerdo quanto direito, totalizando quatro injeções de 0,5 microlitros. Cada camundongo requer dois microlitros de vírus por sessão de injeção.Novamente, tenha cuidado para não injetar no bulbo olfatório qualquer solução viral residual ou sangue que possa escapar do local da injeção ou das aberturas nasais. Usando uma toalha umedecida com etanol, descarte as toalhas no recipiente com água sanitária diluída e coloque imediatamente o camundongo injetado na incubadora com leito d’água para recuperação. Descontamine a agulha e a seringa repetindo o procedimento de esterilização realizado durante a preparação. Os camundongos injetados podem ser devolvidos às suas gaiolas 30 minutos após a recuperação na incubadora com leito d’água.Toda essa microinjeção pode ser repetida novamente após quatro horas. Se desejar aumentar o número de neurônios sensoriais olfativos que serão infectados, os neurônios sensoriais olfativos infectados podem ser visualizados ao longo de todo o comprimento da célula em apenas três dias. Os animais são sacrificados e perfundidos para observação no momento desejado.Utilizando métodos padrão, a fim de visualizar as trajetórias de neurônios sensoriais olfativos transduzidos individualmente e os terminais axonais, dissecamos e seccionamos o bulbo olfativo em corte coronal com espessura de 60 mícrons. Assim, a seção conterá todas as camadas celulares do bulbo olfativo, incluindo feixes de axônios de neurônios sensoriais olfativos e terminais axonais, que fazem sinapse em estruturas glomerulares localizadas na superfície do bulbo, em preparação para a imunohistoquímica em flutuação. São produzidas seções seriadas do bulbo olfativo e coletivamente transferidas para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato.Transfira as seções flutuantes para um frasco cônico de 50 mililitros. Após as seções sedimentarem no fundo do frasco, remova o salino tamponado com fosfato por aspiração. Tenha cuidado para não aspirar as seções.Reponha suas seções com 10 mililitros de tampão fresco para remover qualquer fixador ou material de inclusão residual. Imediatamente, pipete esta suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros, certificando-se de recolher todas as seções flutuantes, remova a solução de lavagem a vácuo e perfure as seções com uma solução de 0,3% de Triton X-100 em tampão salino fosfato, colocando em uma plataforma agitadora por 10 minutos. À temperatura ambiente, você poderá então prosseguir com um protocolo padrão de imunomarcação no mesmo tubo cônico, repetindo os passos de vácuo e agitação conforme necessário para este recipiente, mantendo um volume de 10 mililitros para as etapas de marcação e lavagem.Aqui está uma lista de anticorpos que utilizamos para marcação dupla de neurônios sensoriais olfativos positivamente transduzidos e da população geral de neurônios sensoriais olfativos. Para uma penetração completa dos anticorpos nos cortes de 60 mícrons do bulbo olfativo, recomenda-se incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Os tempos de lavagem também devem ter duração mínima de 20 minutos cada.Espalhe suavemente cada seção em uma lâmina de vidro com um pincel, montando cada lâmina com a solução de montagem flora contendo corante para cromatina. Esforce-se para eliminar todas as bolhas do meio de montagem. Monte suas seções em linhas para facilitar a etapa subsequente de triagem.Analise essas camadas em seus seções de bulbo imunomarcadas em busca de fibras e terminações axônicas positivas para GFP. Utilizando um microscópio fluorescente, terminais nervosos positivamente infectados podem então ser visualizados por microscopia confocal. É útil calibrar o plano focal na sua área de interesse utilizando os canais DPI e proteína marcadora olfativa.Esses resultados mostram uma única fibra axonal e terminal axonal de neurônio sensorial olfativo dentro do glomérulo, que é corado com proteína marcadora olfativa em vermelho e vlu dois em cinza. Os corpos celulares de neurônios sensoriais olfativos infectados e seus botões dendríticos também podem ser visualizados dentro do epitélio olfativo, caso este tecido tenha sido incluído nas etapas de dissecção e imuno-histoquímica. Olá, minha projeção confocal fornece uma morfologia altamente detalhada do trajeto de extensão axonal e da arborização terminal de um único neurônio sensorial olfativo. Pode-se observar o trajeto curvo da fibra axonal em direção ao seu alvo glomerular, bem como os detalhes do seu padrão de ramificação dentro do neuropilo glomerular.O método de microinjeção com lentivírus permite a visualização de axônios individuais, as morfologias dos neurônios sensoriais olfativos e possibilita estudos que manipulam a expressão gênica; a transdução por lentivírus resulta na integração genômica estável dos construtos. O lentivírus não infecta trans-sinapticamente as células vizinhas. A visualização pode ser alcançada em apenas três dias e já foi confirmada por um período de pelo menos três meses, provavelmente persistindo por períodos ainda mais longos.Os neurônios sensoriais olfativos não são facilmente infectados por infusão nasal de solução de lentivírus. Portanto, é necessária uma microinjeção através da superfície neste procedimento. Assim, esse é o nosso procedimento de microinjeção de lentivírus.Espero que você tenha encontrado todas essas informações úteis para alcançar morfologias de células individuais em suas próprias pesquisas. Boa sorte.

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Descrevemos um protocolo para marcação in vivo de neurônios sensoriais olfatórios por eletroporação e subsequente varredura confocal a laser ou microscopia multifotônica para visualizar a morfologia neuronal e seu desenvolvimento ao longo do tempo.

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Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

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Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Descrevemos aqui métodos para induzir e analisar a remodelação olfativa dependente da experiência dos glomérulos sinápticos do lobo antenal no cérebro juvenil de Drosophila .

Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Aprenda a manipulação genética e visualização de neurônios sensoriais olfatórios in vivo usando lentivírus. Este método permite estudar trajetórias axonais individuais e arborizações terminais no sistema olfatório.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo

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