Isolamento de células-alvo baseado em fio funcionalizado: uma técnica ex vivo para isolar células cancerígenas do sangue periférico enriquecido

As moléculas de adesão de células epiteliais, ou EpCAMs, são glicoproteínas transmembranares superexpressas em células epiteliais de proliferação rápida em cânceres de próstata. Para isolar as células que expressam EpCAM, comece com um fio de grau médico com uma ponta revestida de ouro funcionalizada. Camadas de funcionalização de um gel polimérico contendo anticorpos específicos de EpCAM ligados covalentemente.

Mergulhe o fio em uma suspensão de sangue periférico contendo células cancerígenas marcadas com fluorescência. Certifique-se de que a parte funcionalizada permaneça mergulhada na suspensão de sangue. Os EpCAMs nas células cancerígenas reconhecem e se ligam aos seus anticorpos específicos funcionalizados no fio.

Lave com um tampão para remover quaisquer células não ligadas da superfície do fio. Dobre o fio e monte-o em uma lâmina de vidro contendo buffer, com a parte funcionalizada imersa no buffer. Use um microscópio de fluorescência para verificar a fluorescência brilhante do citoplasma e dos núcleos das células e confirmar a presença de células capturadas no fio.

Trate o fio com um tampão de liberação. As enzimas proteolíticas no tampão clivam o gel polimérico, liberando os complexos de células anticorpo-câncer no tampão. Centrifugue o conjunto de fios para coletar os complexos anticorpo-célula liberados no pellet. Remova o fio e o sobrenadante contendo enzimas. Ressuspenda o sedimento contendo a célula-alvo em um meio adequado.

Em 5 mililitros de sangue periférico, adicione cerca de 500 a 500.000 células e misture invertendo o tubo. Depois de remover o fio do compartimento de armazenamento, remova a tampa de borracha que prende o fio e lave o fio em 1x solução salina tamponada com fosfato e monte-o na tampa do tubo. Em seguida, incube o tubo em uma batedeira de rolos inclinada a 5 rotações por minuto por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue o fio em solução salina tamponada com fosfato 1x três vezes. Em seguida, armazene o fio em um tubo de 15 mililitros contendo 1x solução salina tamponada com fosfato no escuro.

Desenhe uma área retangular em uma lâmina de vidro usando uma caneta de graxa e adicione 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1x. Para imergir a parte funcional do fio em 1x solução salina tamponada com fosfato, dobre a parte não funcional do fio e coloque-a na lâmina de vidro. Para contar o número de células capturadas, inspecione visualmente os dois lados do fio. Após a inspeção, transfira o fio de volta no tubo de 15 mililitros com 1x solução salina tamponada com fosfato e mantenha no escuro.

Em 1 mililitro de solução salina tamponada com fosfato, dissolva 4 miligramas do componente tampão de liberação. Em seguida, filtre a solução através de um filtro estéril de 0,2 micrômetro para obter o tampão pronto para uso. Em seguida, aqueça o tampão de liberação a 37 graus Celsius por 5 minutos. Depois de aquecido, transfira 1,6 mililitros de tampão de liberação para encher completamente um tubo de reação de 1,5 mililitro. Em seguida, incube a parte funcional do fio no tampão de liberação a 37 graus Celsius em banho-maria por 20 minutos.

Após a incubação, coloque o fio em um agitador a 500 rotações por minuto por 15 minutos. Em seguida, centrifugue o fio a 300 x g por 10 minutos. Quando a centrifugação terminar, desloque o fio do tubo, feche a tampa e centrifugue o tubo novamente a 300 x g por 10 minutos.