Triagem de morte celular usando coloração DAPI: um método para triagem rápida de morte celular clonogênica induzida por IR em linhagens de células cancerígenas

A exposição a radiações ionizantes, como raios-X, pode causar danos ao DNA, levando à morte celular. Para rastrear o efeito das radiações ionizantes nos perfis de morte celular, comece pegando uma placa de cultura contendo células cancerígenas aderentes colocadas sobre a superfície de uma lamínula.

Irradie a placa de cultura com raios-X durante o período desejado. Este tratamento causa danos ao DNA dentro das células. Em seguida, aspire o meio gasto do prato de cultura e adicione um fixador adequado. Esta solução permeia as células e bloqueia os componentes celulares no lugar durante as etapas de coloração subsequentes.

Descarte a solução fixadora. Remova a lamínula contendo células tratadas com raios-X da placa de cultura. Vire a lamínula e coloque-a na superfície de uma lâmina de vidro carregando uma gota de mancha DAPI sobre ela, de modo que as células fiquem em contato direto com o DAPI.

As moléculas DAPI entram nos núcleos e se ligam aos locais ricos em A-T. do DNA. Agora, visualize as células sob um microscópio de fluorescência. Os núcleos aparecem azuis e exibem morfologias distintas.

As células que mostram núcleos condensados e fragmentados são indicativas de apoptose, morte celular programada. Outros exibindo núcleos multilobados representam que as células estão passando por uma catástrofe mitótica. Aqueles com núcleos achatados mostrando vários pontos brilhantes são sugestivos de células em senescência.

Retire as células da incubadora e aspire o meio de cultura da placa de cultura. Corte a ponta de uma micropipeta de 1.000 microlitros a cerca de 5 milímetros da extremidade usando uma tesoura e use-a para adicionar 1 mililitro de solução de fixação à placa de cultura.

Aplique a solução de fixação ao longo das paredes da placa de cultura para minimizar os danos às células. Em seguida, transfira esta placa de cultura para uma placa de cultura quadrada e agite-a suavemente para distribuir uniformemente a solução de fixação sobre a lamínula. Depois disso, incube o prato por 10 minutos em temperatura ambiente.

Aspire a solução de fixação do prato. Agora, adicione 2 mililitros de PBS ao longo das paredes do prato e aspire o PBS. Para se preparar para a coloração DAPI, adicione 5 microlitros de reagente de coloração DAPI em uma lâmina de vidro. Em seguida, remova a lamínula do prato usando um bisturi e escorra o excesso de PBS na lamínula tocando a borda da lamínula com uma toalha de papel.

Agora, monte a lamínula de cabeça para baixo na gota do reagente de coloração DAPI na lâmina de vidro para que as células sejam expostas ao reagente de coloração DAPI. Finalmente, examine as células coradas sob um microscópio de fluorescência equipado com um filtro DAPI.