Preparação de linhagens de células para Knockdown condicional da expressão gênica e mensuração dos efeitos Knockdown em E4orf4 morte celular induzida por

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito do knockdown de ACF um ou SNF dois H na morte celular induzida por E, quatro ou quatro. Isso é obtido pela geração de linhagens celulares nas quais a expressão de ACF um ou SNF dois H srna é condicionalmente ativada pela adição de doxiciclina, resultando em níveis reduzidos de proteína ACF um ou SNF dois H como uma segunda etapa. As células das linhagens celulares obtidas são tratadas com doxiciclina para reduzir a expressão de ACF um ou SNF dois H ou não são tratadas.

Em seguida, E quatro ou quatro são expressos nas células com ou sem ACF resistente a S-H-R-N-A um ou SNF dois H.In para investigar o efeito de ACF um ou SNF dois H em E quatro ou quatro resultados de morte celular induzida são obtidos que mostram o impacto dos níveis de ACF um ou SNF dois H em E toxicidade de quatro ou quatro com base na contagem de núcleo com morfologia apoptótica usando o ensaio JY. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como a transfecção transitória de RNAs, é que todas as células expressam o S-H-R-N-A e a porcentagem de células co-expressando junto com o plasmídeo tradicional é maior. Este método fornece informações sobre os mecanismos subjacentes se 4 0 4 induzir a morte celular, mas também pode ser aplicado ao estudo de outras proteínas próticas.

Além de Ana Lafe, uma pesquisadora do meu laboratório estará demonstrando partes deste procedimento Para iniciar o procedimento de geração de linhas celulares induzíveis placa T-Rex 2 9 3 células a uma densidade de cerca de cinco vezes 10 elevado a seis células por placa de 10 centímetros em oito mililitros de DMEM contendo soro sem tetraciclina e com cinco microgramas mililitro de blaster de lado em incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Substitua o meio por oito mililitros de meio fresco antes da transfecção. O plasmídeo para transfecção é o plasmídeo P superior neo mais GFP na codificação de ACF um ou SNF dois HSHRNA, acionado por um promotor de tetraciclina induzível por H um, bem como o gene de resistência à neomicina fundido com GFP e acionado por um promotor PGK constitutivo.

Adicione 10 microgramas de DNA de plasmídeo a 500 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar e vórtice. Em seguida, adicione o reagente jet PY a dois microlitros por micrograma de DNA a outro tubo com 500 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar e vórtice. Adicione a solução de torta de jato ao DNA e misture bem por vórtice.

Incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, pipete suavemente os complexos de DNA nas placas de 10 centímetros contendo 70 a 80% de confluência. T-Rex 2 9 3 células uma mistura no dia seguinte.

Substitua o meio por um meio seletivo neste exemplo DMEM como antes, contendo 500 microgramas por mililitro de G quatro 18. Nas próximas duas semanas, monitore as células. Substituir o meio selectivo por um meio fresco semelhante de três em quatro dias até ao aparecimento de colónias.

Identifique as colônias a olho nu e marque sua localização na parte inferior da placa usando um marcador colorido. Verifique ao microscópio se as colônias estão bem separadas. As colônias podem ser isoladas quando forem grandes o suficiente para serem visualizadas sem um microscópio.

Para o sucesso deste procedimento, é importante escolher colônias bem separadas durante o isolamento da colônia. Em um capuz estéril, aspire o meio da placa. Enxágue suavemente com PBS e aspire bem todo o líquido restante.

Adicione três microlitros de 0,25% de viagens em EDTA a uma colônia na placa por acariciar as viagens repetidamente até que as células se desprendam da placa. Transfira as células para um meio seletivo em um poço em uma placa de 24 poços. Repita isso para várias outras colônias no prato.

Cultive as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono até que elas encham o poço. Em seguida, divida as células de cada colônia original em três poços, cada um em uma placa separada de 12 poços e incube durante a noite no dia seguinte. Substituir o meio de uma placa por um meio que contenha um micrograma por mililitro de doxiciclina proveniente de uma solução-mãe preparada em água bidestilada

Substitua o meio em uma placa de controle por meio sem doxiciclina. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 72 horas. As células de um poço tratado e um não tratado são então colhidas para análise de western blot para determinar a eficiência de ACF um ou SNF dois H derrubados, um resultado representativo é mostrado aqui.

Esta mancha foi corada com anticorpos para SNF dois H e alfa tubulina. Este último servindo como controle de carregamento de dois dos clones. O número quatro e o número cinco mostraram uma forte redução no SNF dois H após a indução da doxiciclina e, portanto, são escolhidos para uso no experimento de knockdown, que será demonstrado no próximo segmento.

As células não tratadas na terceira placa serão usadas para expandir a linha celular selecionada e as alíquotas dessas células serão posteriormente congeladas. Para uso posterior para induzir o knockdown de células da placa ACF um ou SNF duas H em meio seletivo em placas de 10 centímetros, adicione doxiciclina a um micrograma por mililitro à metade das placas e incube 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas. Cada grupo de placas deve fornecer as células para 12 placas de seis centímetros, incluindo duas duplicatas para o ensaio DPI para cada ponto, bem como uma placa para análise de western blot de cada amostra.

48 a 72 horas após a indução tripsina nariz as células de cada grupo de células e após a contagem das plaquetas 1,5 vezes 10 elevado a seis células por placa de seis centímetros no mesmo meio com ou sem doxiciclina. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono durante a noite no dia seguinte, transfecte as células. Conforme indicado.

Tanto as células tratadas quanto as tratadas com doxiciclina são transfectadas em triplicata de quatro maneiras. Um com um plasmídeo vazio e um plasmídeo expressando GFP, dois com o plasmídeo vazio, bem como um vetor expressando ACF resistente a SHRA, um GFP ou SNF, dois HGFP, três com um plasmídeo codificando E, quatro ou quatro, e um plasmídeo expressando GFP e com o plasmídeo codificando E, quatro, todos os quatro. E o vetor que expressa ACF resistente a SHRA um GFP ou SNF dois HGFP após a transfecção incuba todas as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite.

No dia seguinte à transfecção das células, extraia proteínas de uma placa por amostra para análise de Western blot para determinar que ACF um ou SNF dois H foi eficientemente derrubado e que E quatro ou quatro foi expresso igualmente nas diferentes amostras. As 16 placas restantes serão usadas para o ensaio DPI. Aspirar o meio das placas destinadas ao ensaio de IPD e lavar as células suavemente com PBS numa capa química.

Adicione um mililitro de formaldeído a 4% para preparado em PBS para cobrir as células, incubar por 15 minutos em temperatura ambiente sem agitar. Aspire o paraformaldeído e lave com PBS agitando em temperatura ambiente por cinco minutos. Repita a lavagem mais duas vezes para um total de três lavagens após a terceira lavagem PBS a 80% Etanol mantido a menos 20 graus Celsius e incube a menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora.

Aspire o etanol e lave as células duas vezes com PBS agitando em temperatura ambiente por cinco minutos de cada vez, depois lave uma vez por cinco minutos em temperatura ambiente com PBS contendo 0,5% BSA e 0,05% entre 20 ou PBSBT. Também com agitação para evitar a ligação de anticorpos não específicos. Bloqueie as células em um mililitro de tampão PBSB contendo 10% de soro de cabra por 20 minutos, agitando em temperatura ambiente.

Em seguida, lave as células duas vezes em P-B-S-B-T cinco minutos a cada lavagem. Incube as células com o anticorpo primário, um anticorpo específico E, quatro ou quatro, neste caso, em um mililitro de P-B-S-B-T por uma hora enquanto agita a temperatura ambiente. Em seguida, lave duas vezes em PBSB e uma vez em PBS contendo 0,1% BSA cinco minutos cada lavagem.

Em seguida, adicione às células um mililitro de PBS 0,1% BSA contendo o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado e 0,5 microgramas por mililitro. Concentração final de DPI incubar por 40 minutos enquanto agita à temperatura ambiente no escuro. Por fim, lave com PBS por cinco minutos.

Seque o poço por aspiração e mantenha as placas de cabeça para baixo por mais uma hora durante a noite para obter a secagem completa e cubra com lâminas de cobertura de montagem de folha de alumínio nas células usando a solução flora Mount G. Mantenha as placas a quatro graus Celsius no escuro até que estejam prontas para contar. As células dos núcleos apoptóticos submetidos aos vários tratamentos descritos no protocolo foram fixadas e coradas com E, quatro ou quatro anticorpos específicos e IPS, para visualizar os núcleos das células transfectadas.

Esta figura mostra um exemplo de células expressando E quatro ou quatro e o painel GFP A mostra a expressão da proteína GFP de controle sozinha, e o painel B mostra E quatro ou quatro núcleos de coloração DAPI de expressão são mostrados no painel C e as imagens mescladas são mostradas no painel D. As setas brancas marcam, GFP e E. Quatro ou quatro células transfectadas contendo núcleos com morfologia apoptótica. As setas vermelhas marcam núcleos com formas irregulares que não são contadas como núcleos apoptóticos, o asterisco marca núcleos mitóticos ou núcleos que apenas dividiram o número de núcleos condensados ou fragmentados visualizados pelo DAPI. A coloração foi contada para calcular a porcentagem de núcleos com morfologia apoptótica dentro da população de células transfectadas para manter a objetividade ideal do teste.

A contagem do núcleo apoptótico nas várias amostras foi realizada de forma cega, onde a pessoa que contava não estava ciente da identidade da amostra Um resultado representativo é mostrado neste gráfico. Maiores porcentagens de anormalidades nucleares foram observadas em E quatro ou quatro células que expressam confirmando que T quatro ou quatro induzem a morte celular. A maior porcentagem de anormalidades nucleares foi observada em E quatro ou quatro células que expressam onde os níveis de ACF um foram reduzidos por SHR e um knockdown mediado indicando que o knockdown de ACF um aumenta E quatro ou quatro A morte celular de Inge aumentou E quatro ou quatro toxicidade nas células.

A expressão de baixos níveis de ACF um não resultou de um aumento nos níveis de E quatro ou quatro, como visto no Western blot. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de facilitar uma contagem aconselhada do stent do núcleo apoptótico com IPS e aplicar critérios rigorosos para a identificação desse núcleo. Além deste procedimento, outros métodos, como ensaios clongênicos, podem ser realizados para validar os resultados do DA pse Após este procedimento.

Outros métodos, como ensaios de co-imunoprecipitação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, se existe uma interação física entre as proteínas investigadas.