Coloração fluorescente de prata: uma técnica para visualizar a proteína total em géis de poliacrilamida

A coloração fluorescente de prata de proteínas em géis de poliacrilamida emprega sondas fluorogênicas para detectar e quantificar as proteínas.

Comece com um gel de poliacrilamida com proteínas, separadas em bandas por eletroforese. Mergulhe em uma mistura fixadora de etanol e ácido acético, que impede que as bandas se difundam desnaturando as proteínas.

Lave o gel para remover o ácido acético residual e o etanol. Mergulhe o gel na mancha de nitrato de prata. Os íons de prata se ligam fortemente a grupos carregados negativamente nas proteínas.

Incubar no escuro. Enxágue o gel em água ultrapura para remover complexos de íons de prata não ligados.

Mergulhe o gel em uma solução de revelação contendo uma sonda fluorogênica multicomponente - TPE-4TA. Esta sonda aniônica tem como alvo os íons de prata ligados à proteína, formando agregados insolúveis que ativam as propriedades fluorogênicas da sonda, conferindo fluorescência.

Como a ativação da fluorescência depende da agregação, as sondas não ligadas não emitem nenhum sinal, permitindo a coloração total da proteína com emissão de fundo reduzida.

Incube o gel no escuro com agitação suave, garantindo um desenvolvimento fluorogênico completo. Transfira o gel em um tampão de destain para remover as sondas não ligadas. Por fim, faça a imagem do gel para obter a intensidade do sinal da banda. Representar graficamente a intensidade do sinal de fluorescência em relação à curva padrão de proteínas para calcular a quantidade total de proteínas na amostra.

Após a eletroforese, mergulhe o gel em uma solução de 100 mililitros contendo etanol e ácido acético em um agitador orbital e incube duas vezes por 30 minutos cada, à temperatura ambiente, agitando a 50 RPM. Em seguida, lave o gel três vezes com água ultrapura em um recipiente limpo, com cada lavagem durando 10 minutos.

Primeiro, dissolva 0,01 gramas de nitrato de prata em 10 mililitros de água ultrapura para preparar uma solução estoque com concentração de 0,1%. Adicione 100 microlitros desta solução estoque em 100 mililitros de água ultrapura para fazer a solução de trabalho de nitrato de prata. Em uma capela de exaustão, mergulhe o gel em 100 mililitros da solução de trabalho de nitrato de prata em uma câmara de vidro selada.

Use papel alumínio para proteger o gel da luz durante a impregnação e incube por 1 hora agitando a 50 RPM em um agitador orbital. Em seguida, lave o gel duas vezes com água ultrapura em um recipiente limpo, com cada lavagem usando aproximadamente 100 mililitros de água e durando 60 segundos.

É importante usar água ultrapura para limpar o gel após a etapa de impregnação de prata para minimizar a coloração de fundo.

Primeiro, adicione 50 mililitros de água ultrapura a 3 miligramas de corante TPE-4TA. Sonicar a solução por 3 minutos e adicionar 5 microlitros de solução de hidróxido de sódio 1 molar entre cada sessão de sonicação, para ajudar a dissolver o corante, geralmente até três vezes. Em seguida, verifique a fluorescência da solução sob uma lâmpada UV de 365 nanômetros para garantir que o corante esteja totalmente dissolvido. Apenas soluções fracas ou não emissivas indicam dissolução total.

Para preparar a solução de revelação fluorogênica, adicione 10 mililitros da solução estoque TPE-4TA a 90 mililitros de água ultrapura. Use um medidor de pH para verificar o pH da solução. Ajustar a solução para um pH entre 7 e 9, utilizando uma solução diluída de hidróxido de sódio ou ácido acético, se o pH estiver fora do intervalo.

Em seguida, transfira o gel para um recipiente limpo e lacrado com 100 mililitros da solução de revelação fluorogênica e certifique-se de que o gel esteja completamente imerso. Feche o recipiente e cubra-o para protegê-lo da luz. Agite o recipiente durante a noite em um agitador orbital a 50 RPM e à temperatura ambiente.

Transfira o gel para um recipiente limpo e desmanche-o em 100 mililitros de etanol a 10% por 30 minutos. Em seguida, enxágue o gel em água ultrapura por 5 minutos. O gel pode ser visualizado em um transiluminador de bancada ou em uma máquina de documentação de gel no canal de 365 nanômetros ou no canal de 302 nanômetros.