Coloração Proteínas em Gel

Em um vídeo anterior intitulado Separação Eletroforética de Proteínas, demonstramos como uma mistura complexa de proteínas pode ser separada usando eletroforese em gel. Neste vídeo, mostraremos a você quatro métodos diferentes de coloração de géis para visualizar a localização das proteínas no gel. Olá, sou Sean Gallagher da UVP, trabalhando com o Centro de Proteômica aqui no Instituto de Pós-Graduação KEG.

Hoje vou mostrar a você várias técnicas para visualizar proteínas após a separação por eletroforese. Isso inclui a coloração azul de prata de Kamasi, cyro laranja e cyro ruby. Então vamos começar com a Kamasi blue primeiro.

A detecção de bandas proteicas em um gel por coloração com azul de Kamasi depende da ligação não específica de um corante. Neste caso, azul brilhante de Kamasi G dois 50. Neste método, as proteínas separadas em um gel de poliacrilamida são lavadas utilizando água de alta pureza.

A localização das proteínas é então detectada utilizando uma coloração azul de kamasi à base de água. O limite de detecção é de 0,3 a um micrograma por banda proteica. Para começar, inicie com um gel de poliacrilamida no qual as proteínas foram separadas por eletroforese.

Enquanto agita lentamente, coloque o gel de poliacrilamida em um recipiente plástico contendo 300 mililitros de água de alta pureza. Deixe por cinco minutos. Descarte e repita mais duas vezes após a terceira lavagem.

Descarte a água e cubra o gel com a solução corante Kamasi blue por uma hora, agitando lentamente. Após uma hora de coloração, descarte a solução corante. Enxágue o gel brevemente colocando-o em cerca de 200 mililitros de água por 30 minutos. Neste ponto, o gel pode ser armazenado em água para imagens futuras.

O gel também pode ser seco nesta etapa para manter um registro permanente do gel. Para isso, coloque o gel sobre duas folhas de papel filtro Watman de 3 mm e cubra a parte superior com filme plástico. Em seguida, seque em um secador de géis convencional por uma a duas horas a cerca de 80 graus celsius.

Outro método de coloração de proteínas é a coloração por prata, que demonstraremos a seguir. Embora o método de coloração com azul de Kamasi seja mais fácil e mais rápido, a coloração por prata é consideravelmente mais sensível, com um limite de detecção de 0,3 nanogramas de BSA. A detecção de bandas proteicas em um gel pela coloração com prata depende da ligação de prata a diversos grupos químicos presentes na proteína.

O protocolo a seguir é baseado no kit de coloração com prata Silver Quest da in Vitrogen. O protocolo é derivado do método de coloração rápida, com duração aproximada de 30 minutos, e representa uma das muitas químicas baseadas em kits utilizadas para coloração com prata compatível com espectrometria de massas. Neste caso, utilizaremos um gel mini pré-moldado da in Vitrogen antes de iniciar a coloração com prata.

Use luvas o tempo todo para evitar contaminação por impressões digitais. Coloque o gel em uma bandeja resistente ao micro-ondas com 100 mililitros de água grau reagente. Enxágue brevemente e, em seguida, descarte a água.

Em seguida, adicione 100 mililitros de fixador, composto por etanol 40%, ácido acético 10% em água de alta pureza, e aqueça em forno de micro-ondas por 30 segundos. O processo em micro-ondas reduz os passos necessários de incubação ao acelerar a ligação e a coloração. Neste momento, coloque o gel em um agitador e agite lentamente por cinco minutos.

Após cinco minutos, descarte o fixador, adicione 100 mililitros de etanol a 30% e aqueça em forno de micro-ondas por 30 segundos, depois coloque o gel em agitador durante cinco minutos. Após cinco minutos, descarte o etanol. Adicione agora 100 mililitros do reagente sensibilizante, aqueça em forno de micro-ondas por 30 segundos e depois coloque em agitador por dois minutos.

Após os dois minutos, descarte o reagente sensibilizante. Adicione 100 mililitros de água grau reagente, aqueça por 30 segundos no micro-ondas e coloque em agitação por dois minutos. Descarte e repita, totalizando dois ciclos de lavagem.

Agora, adicione 100 mililitros de solução corante, aqueça no micro-ondas por 30 segundos e agite lentamente durante cinco minutos. Após os cinco minutos, descarte a solução corante. Adicione 100 mililitros de água grau reagente, pule o micro-ondas, a etapa e coloque diretamente em um agitador por 20 a 60 segundos.

Descarte a água e adicione imediatamente 100 mililitros da solução reveladora, revelando até que as bandas proteicas fiquem visíveis. Com o fundo permanecendo claro, isso levará aproximadamente de cinco a 10 minutos. Neste momento, adicione 10 mililitros da solução de parada ao revelador para interromper a revelação, obtendo os melhores resultados.

Fotografe o gel o mais rápido possível, pois podem ocorrer pequenas alterações na intensidade da cor e aumento de elementos de fundo não específicos. Com o tempo, o gel que você está observando contém proteínas residuais. Após o eletro-blotting, seque o gel para manter um registro permanente ou armazene em um saco plástico selável. Em seguida, demonstramos um método para coloração fluorescente de géis.

Os corantes fluorescentes apresentam diversas vantagens em comparação com os corantes tradicionais para proteínas. Os corantes para géis de proteínas Cipro laranja, que descreveremos aqui, podem detectar de um a dois nanogramas de proteína por banda. Isso é mais sensível do que a coloração com azul brilhante de Kamasi e tão sensível quanto muitas técnicas de coloração pela prata.

A coloração fluorescente é simples, exigindo menos tempo de manipulação do que os protocolos típicos de coloração por prata, e é concluída em menos de uma hora. As proteínas coradas podem ser visualizadas usando um transiluminador padrão de 300 nanômetros de UV ou um escâner a laser. Neste caso, novamente utilizaremos um gel mini pré-moldado da in vitrogen para preparar e separar as proteínas usando eletroforese SDS-PAGE.

Mas use SDS a 0,05% no tampão de corrida em vez do SDS a 0,1% usual para reduzir a fluorescência de fundo. Para iniciar o procedimento de coloração, despeje a solução fluorescente de corante cipro em um recipiente plástico pequeno para um ou dois géis mini de tamanho padrão. Use cerca de 50 mililitros de solução de coloração.

É importante observar que as placas para coloração devem ser limpas e enxaguadas cuidadosamente antes do uso, pois quaisquer detergentes interferirão na coloração. Agora, coloque o gel na solução de coloração. Cubra o recipiente com papel alumínio para proteger o corante da luz intensa.

Agite suavemente o gel à temperatura ambiente durante 40 a 60 minutos. Descarte a solução de coloração e, em seguida, enxágue o gel por menos de um minuto com ácido acético 7,5%, cerca de 100 mililitros, para remover o corante em excesso da superfície do gel. Detenha o gel incubando-o durante a noite em tween 20 0,1% para visualizar e fotografar as bandas proteicas. Coloque o gel marcado com fluoróforo diretamente sobre um transiluminador padrão de 300 nanômetros ou um transiluminador de luz azul.

Em seguida, demonstraremos um método alternativo de coloração fluorescente, que utiliza o corante fluorescente Cipro ruby. O método de coloração com Cipro ruby foi desenvolvido especialmente para uso em eletroforese bidimensional, mas mostrou-se o corante de géis proteicos mais sensível para a eletroforese padrão unidimensional em SDS-PAGE. Para começar, transfira o gel para um recipiente limpo de polipropileno ou PVC de tamanho apropriado.

Incube o gel na quantidade apropriada de corante para proteínas em gel cipro ruby não diluído, com agitação suave contínua em um agitador orbital a 50 rpm. Cubra o gel e incube por pelo menos três horas. Transfira o gel para um recipiente de coloração limpo e lave-o uma vez com solução de 10% metanol, 7% ácido acético, recupere e coloque o gel de volta no agitador por 30 minutos.

Para reduzir a fluorescência de fundo e aumentar a sensibilidade, o gel está agora pronto para ser visualizado e fotografado. Gostaria de agradecer por assistir aos protocolos de hoje. Mostramos a você uma série de procedimentos diferentes para visualizar proteínas após eletroforese.

Alguns são muito sensíveis, como a coloração fluorescente e a coloração com prata, e outros são convencionais, como a coloração com azul de kamasi. É importante lembrar que a pureza dos reagentes é essencial. O uso de água ultrapura também é muito importante, assim como o tempo de cada uma das etapas.

Você precisa prestar muita atenção a isso para obter resultados reprodutíveis também. É isso, e boa sorte em seu próximo conjunto de experimentos.