Coloração Proteínas em Gel

Em um vídeo anterior intitulado Separação eletroforética de proteínas, demonstramos como uma mistura complexa de proteínas pode ser separada usando eletroforese em gel. Neste vídeo, mostraremos quatro métodos diferentes de coloração de gel para visualizar a localização das proteínas no gel. Olá, sou Sean Gallagher, da UVP, trabalhando com o Centro de Proteômica aqui no Instituto de Pós-Graduação KEG.

Hoje vou mostrar a vocês uma série de técnicas para visualizar proteínas após a separação por eletroforese. Isso inclui coloração de prata azul Kamasi, laranja cyro e rubi cyro. Então, vamos começar com o Kamasi blue First.

A detecção de proibições de proteínas em um gel pela coloração com azul de Kamasi depende da ligação não específica de um corante. Neste caso, Kamasi azul brilhante G dois 50. Neste método, as proteínas separadas em um gel de poliacrilamida são lavadas com água de alta pureza.

A localização das proteínas é então detectada usando uma coloração azul kamasi à base de água. O limite de detecção é de 0,3 a um micrograma por banda de proteína. Para começar, comece com um gel de poliacrilamida no qual as proteínas foram separadas por eletroforese.

Enquanto agita lentamente, coloque o gel de poliacrilamida em um recipiente de plástico cheio de 300 mililitros de água de alta pureza. Deixe por cinco minutos. Descarte e repita mais duas vezes após a terceira lavagem.

Despeje a água e cubra o gel com a solução de coloração azul Kamasi por uma hora, agitando lentamente após uma hora de coloração, despeje a solução de coloração. Enxágue o gel brevemente colocando cerca de 200 mililitros de água por 30 minutos. Neste ponto, o gel pode ser armazenado em água para imagens futuras.

O gel também pode ser seco nesta fase para manter um registro permanente do gel. Para fazer isso, coloque o gel em duas folhas de papel de filtro Watman de três mm e cubra a parte superior com filme plástico. Em seguida, seque em um secador de gel convencional por uma a duas horas a cerca de 80 graus Celsius.

Outro método de coloração de proteínas é por coloração de prata, que demonstraremos a seguir. Embora o método de coloração com azul de Kamasi seja mais fácil e rápido, a coloração com prata é consideravelmente mais sensível, com um limite de detecção de 0,3 nanogramas de BSA. A detecção de bandas de proteína em um gel por coloração de prata depende da ligação da prata a vários grupos químicos na proteína.

O protocolo a seguir é baseado no kit de coloração de prata Silver Quest da Vitrogen. O protocolo é derivado do protocolo de coloração rápida, aproximadamente 30 minutos e representa uma das muitas químicas baseadas em kits usadas para coloração de prata compatível com espectrometria de massa. Nesse caso, usaremos um mini gel pré-moldado in vitrogen antes de iniciar a coloração com prata.

Certifique-se de usar luvas o tempo todo para evitar a contaminação das impressões digitais. Coloque o gel em uma bandeja própria para micro-ondas com 100 mililitros de água reagente. Enxágue brevemente e despeje a água.

Em seguida, adicione 100 mililitros de fixador, composto por 40% de etanol, 10% de ácido acético em água de alta pureza e leve ao microondas por 30 segundos. O processo de micro-ondas encurta as etapas de incubação necessárias, acelerando a ligação e a coloração. Neste ponto, coloque o gel em uma coqueteleira e balance lentamente por cinco minutos.

Após cinco minutos, despeje o fixador, adicione 100 mililitros, 30% de etanol para lavar o gel no microondas por 30 segundos e, em seguida, coloque o gel em uma coqueteleira por cinco minutos. Após cinco minutos, despeje o etanol. Agora adicione 100 mililitros de reagente sensibilizante no microondas por 30 segundos e coloque em uma coqueteleira por dois minutos.

Após os dois minutos, despeje o reagente sensibilizante. Adicione 100 mililitros de água reagente no micro-ondas por 30 segundos e coloque em uma coqueteleira por dois minutos. Despeje e repita por um total de dois ciclos de lavagem.

Agora adicione 100 mililitros de solução de coloração, leve ao microondas por 30 segundos e agite lentamente por cinco minutos. Após os cinco minutos, despeje a solução de coloração. Adicione 100 mililitros de água de grau reagente, pule o micro-ondas, pise e coloque diretamente em uma coqueteleira por 20 a 60 segundos.

Descarte a água e adicione imediatamente 100 mililitros da solução de revelação e desenvolva até que as bandas de proteína se tornem visíveis. Com o fundo permanecendo claro, isso levará aproximadamente cinco a 10 minutos. Neste ponto, adicione 10 mililitros de solução de rolha ao revelador para interromper o desenvolvimento e obter melhores resultados.

Fotografe o gel o mais rápido possível, pois pode haver pequenas alterações na intensidade da cor e aumentos em elementos de fundo não específicos. Com o tempo, o gel que você está vendo contém proteínas residuais Após o electro blotting, seque o gel para manter um registro permanente ou armazene em um saco plástico lacrável. Em seguida, demonstramos um método para géis de coloração fluorescente.

Os corantes fluorescentes têm várias vantagens sobre os corantes proteicos tradicionais. As manchas de gel de proteína laranja Cipro, que descreveremos aqui, podem detectar de um a dois nanogramas de proteína por banda. Isso é mais sensível do que a coloração azul brilhante kamasi e tão sensível quanto muitas técnicas de coloração de prata.

A coloração fluorescente é simples, com menos tempo de trabalho do que os protocolos típicos de coloração de prata e é concluída em menos de uma hora. As proteínas coradas podem ser visualizadas usando um transiluminador UV padrão de 300 nanômetros ou um scanner a laser. Neste caso, usaremos novamente um mini gel pré-moldado in vitrogen para começar a preparar e separar proteínas usando a página SDS.

Mas use 0,05% SDS no buffer de execução em vez do 0,1% SDS usual para reduzir a fluorescência de fundo. Para iniciar o procedimento de coloração, despeje a solução de coloração fluorescente de laranja cipro em um pequeno prato de plástico para um ou dois mini géis de tamanho padrão. Use cerca de 50 mililitros de solução de coloração.

É importante observar que a louça de coloração deve ser limpa e enxaguada bem antes do uso, pois qualquer detergente interferirá na coloração. Agora, coloque o gel na solução de coloração. Cubra o recipiente com papel alumínio para proteger o corante da luz forte.

Agite suavemente o gel em temperatura ambiente por 40 a 60 minutos. Descarte a solução de coloração e enxágue o gel por menos de um minuto com ácido acético a 7,5%, cerca de 100 mililitros para remover o excesso de mancha da superfície do gel, detenha o gel incubando durante a noite em 0,1% entre 20 para visualizar e fotografar bandas de proteína. Coloque o gel marcado com fluorescência diretamente em um transiluminador padrão de 300 nanômetros ou em um transiluminador de luz azul.

A seguir, demonstraremos um método alternativo de coloração fluorescente, que usa corante fluorescente Cipro rubi. O método de coloração Cipro ruby foi projetado especialmente para uso em página bidimensional, mas provou ser a coloração de gel de proteína mais sensível para a página SDS unidimensional padrão. Para começar, transfira o gel para um prato limpo de polipropileno ou PVC de tamanho apropriado.

Incubar o gel na quantidade apropriada de coloração de gel de proteína de rubi cipro não diluída com agitação suave contínua em um agitador orbital a 50 RPMs. Cubra o gel e incube por pelo menos três horas. Transfira o gel para uma mancha limpa e lave-o uma vez em uma solução de ácido acético a 10% de metanol e 7%, recupere e coloque o gel de volta no balancim por 30 minutos.

Para reduzir a fluorescência de fundo e aumentar a sensibilidade, o gel agora está pronto para ser visualizado e fotografado. Quero agradecer por assistir aos protocolos de hoje hoje. Mostramos vários procedimentos diferentes para visualizar proteínas após a eletroforese.

Alguns são muito sensíveis, como a coloração fluorescente e a coloração de prata, e alguns são rotineiros, como a coloração azul kamasi. É importante lembrar que a pureza do reagente é crítica. O uso de água ultrapura também é muito importante, assim como o tempo em cada uma das etapas.

Você precisa prestar muita atenção a isso para obter resultados reprodutíveis também. É isso e boa sorte em seu próximo conjunto de experimentos.