Ensaio Colorimétrico para a Quantificação de Carboidratos Não Estruturais em Tecidos Vegetais

Os carboidratos digeríveis são os componentes não estruturais do tecido vegetal e funcionam como uma fonte de energia de reserva para o crescimento e metabolismo das plantas.

Para quantificar os carboidratos não estruturais, pegue uma quantidade medida de tecido vegetal em um tubo. Adicione ácido sulfúrico diluído ao tubo e aqueça a amostra. Após o aquecimento, o ácido sulfúrico hidrolisa os polissacarídeos dos carboidratos digeríveis em suas respectivas subunidades monossacarídicas.

Resfrie a amostra. Centrifugar o tubo para peletar o material vegetal não digerido e obter um sobrenadante contendo os monossacarídeos.

Aspirar o sobrenadante para um tubo novo e tratar os monossacarídeos com solução de fenol, seguido da adição de ácido sulfúrico. Vortex o tubo para misturar o conteúdo e incubar.

Durante a incubação, o ácido sulfúrico desidrata os monossacarídeos para produzir derivados de furfural. Esses derivados de furfural reagem com o fenol para produzir uma solução de ouro amarelo.

Determine espectroscopicamente a absorbância da solução de ouro amarelo a 490 nanômetros, que corresponde ao teor de carboidratos na amostra da planta.

Em seguida, pegue várias concentrações de soluções de glicose e repita o tratamento com fenol-ácido sulfúrico para produzir diferentes intensidades de cor e trace uma curva padrão. Compare o valor de absorbância da amostra de carboidrato desconhecido com o padrão de glicose para obter o conteúdo de carboidratos digeríveis no tecido vegetal.

Primeiro, pese as réplicas de cada amostra de tecido em tubos de vidro de 15 mililitros. Rotule os tubos e registre a massa exata de cada amostra.

Em seguida, adicione 1 mililitro de ácido sulfúrico 0,1 molar a cada tubo e feche bem as tampas. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria fervente por 1 hora.

Transfira os tubos para um banho-maria morno para esfriar. Em seguida, despeje o conteúdo dos tubos em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados. Depois disso, centrifugue os tubos a 15.000 g por 10 minutos. Use uma micropipeta para transferir o sobrenadante para novos tubos rotulados de 1,5 mililitro.

Usando uma pipeta, transfira 15 microlitros de cada amostra desconhecida para seu próprio tubo de ensaio. Em seguida, adicione 385 microlitros de água destilada a cada tubo.

Em uma capela de exaustão, adicione 400 microlitros de fenol a 5% a cada tubo de ensaio de amostra padrão e desconhecido. Em seguida, adicione 2 mililitros de ácido sulfúrico a cada tubo.

Certifique-se de adicionar o ácido sulfúrico à superfície da solução.

Depois de incubar os tubos por 10 minutos, vórtice os tubos. Em seguida, incube o tubo por mais 30 minutos.

Transfira 800 microlitros de cada tubo de amostra para três cubetas semimicro de poliestireno de 1,5 mililitro. Em seguida, ajuste o espectrofotômetro para ler 490 nanômetros e calibre-o com uma cubeta em branco.

Finalmente, passe cada cubeta pelo espectrofotômetro e registre a absorbância.