Ensaio de eletroquimioluminescência para quantificação dos níveis de proteína-alvo no lisado cerebral

Para detecção quantitativa de uma proteína específica no lisado cerebral de camundongo usando a eletroquimioluminescência, ECL, imunoensaio, comece com uma placa de ensaio de vários poços.

Os poços compreendem eletrodos de trabalho e contra-eletrodos condutores, completando o circuito elétrico. Uma camada dielétrica separa os eletrodos, melhorando a sensibilidade do ensaio.

Adicione anticorpos monoclonais primários de camundongo contra a proteína-alvo aos poços. Os eletrodos de trabalho, com maior capacidade de ligação, facilitam a imobilização dos anticorpos sobre eles.

Incubar com uma solução contendo proteínas, ligando-se às superfícies de ligação restantes do poço, reduzindo a interferência de fundo.

Adicione lisado de fração nuclear do cérebro de camundongo. A proteína-alvo no lisado se liga especificamente aos anticorpos monoclonais.

Adicione anticorpos policlonais não marcados, reconhecendo e ligando-se a epítopos na proteína, que está ligada a anticorpos monoclonais primários no eletrodo. Adicione anticorpos secundários específicos marcados com complexo de rutênio, ligando-se aos anticorpos não marcados. Adicione um tampão adequado contendo surfactante - fornecendo um ambiente de geração de ECL adequado - e tripropilamina, TPA.

Coloque a placa de vários poços no sistema de detecção de ECL. Após a aplicação de potencial através dos eletrodos, o complexo de rutênio ligado aos anticorpos é oxidado. Ao mesmo tempo, o TPA é oxidado e perde espontaneamente um próton.

O radical TPA resultante reduz o complexo de rutênio oxidado ao seu estado excitado. Após o relaxamento ao seu estado fundamental, o complexo de rutênio emite um fóton detectado pelo fotodetector.

A intensidade da luz medida é representativa da concentração de proteína específica do lisado.

Recupere a placa de 96 poços da geladeira e remova o papel alumínio. Remova a solução de revestimento de anticorpos dos poços jogando-a em um recipiente de resíduos. Em seguida, bata o prato em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante.

Em seguida, adicione 125 microlitros de solução de bloqueio a cada poço. Em seguida, sele a placa novamente com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de microplacas orbital, regulado para 800 RPM, e incube-o por 90 minutos em temperatura ambiente.

Descongele no gelo, um frasco de solução estoque de proteína MeCP2 ou TAT-MeCP2, lisados cerebrais de camundongos e lisados HDF. Diluir a solução de estoque de proteína em tubos limpos, conforme descrito na Tabela 2 do manuscrito.

Em seguida, dilua as amostras de lisado. Para os lisados cerebrais de camundongos, use de 1 a 20 microgramas por 25 microlitros de tampão de lise. Para o lisado de HDF, adicione 0,25 a 1 micrograma por 25 microlitros de tampão de lise.

Depois que a placa de 96 poços for incubada por 90 minutos, remova a solução de bloqueio dos poços jogando-a em um recipiente de lixo. Em seguida, bata o prato em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Em seguida, lave a placa 3 vezes com 150 microlitros de solução de lavagem, adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.

Adicione 25 microlitros de padrões e amostras aos poços da placa de 96 poços. Feche a placa e incube-a por mais quatro horas em temperatura ambiente, com agitação constante de 800 RPM.

Descongele o anticorpo de detecção não marcado, anti-MeCP2 policlonal de coelho, no gelo. Usando a solução diluente do ensaio, diluir o anticorpo na proporção de 1:6000. Quando a placa de 96 poços terminar de incubar no agitador, remova os padrões e as amostras sacudindo a placa em um recipiente de resíduos. Em seguida, bata o prato em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante.

Lave a placa 3 vezes com 150 microlitros de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microlitros de solução de anticorpos de detecção não rotulada a cada poço com o pipetador multicanal. Feche a placa e incube-a por 1 hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM.

Obtenha o anticorpo secundário específico da geladeira e coloque-o no gelo. Diluir o anticorpo secundário em solução diluente de ensaio e misturar suavemente.

Para remover o anticorpo de detecção livre não rotulado da placa de 96 poços, coloque-o no recipiente de resíduos e, em seguida, bata na placa em uma toalha de papel. Depois de lavar a placa 3 vezes, conforme descrito anteriormente, adicione 25 microlitros de anticorpo secundário a cada poço com o pipetador multicanal. Feche a placa e incube-a por 1 hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM.

Remova o anticorpo secundário livre jogando-o no recipiente de resíduos e batendo na placa em uma toalha de papel e, em seguida, lave a placa três vezes conforme descrito anteriormente.

Para cada poço da placa, adicione 150 microlitros de tampão de leitura de ouro 1X à base de tris com surfactante, contendo tripropilamina como co-reagente para geração de luz.

Para evitar a produção de bolhas de ar, use técnicas de pipetagem reversa. Coloque a placa de 96 poços na plataforma de microplacas com um sistema de detecção de eletroquimioluminescência.

Usando a câmera CCD integrada, comece imediatamente a capturar dados. Registre as contagens de sinal que correspondem a unidades de luz relativas e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.