Classificação de células baseada em citometria de fluxo para diferentes populações de células B circulatórias

Com base em seus receptores de superfície celular, as células B circulantes humanas são classificadas como células B virgens CD19 positivas, células B de memória CD19 e CD27 positivas e plasmablastos CD19, CD27 e CD38 positivos.

Para classificar essas populações de células, tome uma suspensão purificada de células B. Incubar com anticorpos de imunoglobulina G humana. Os anticorpos bloqueiam os receptores Fc das células B, impedindo a ligação de anticorpos inespecíficos.

Adicione anticorpos marcados com fluorescência direcionados a CD19, CD27 e CD38.

Os anticorpos anti-CD19 se ligam aos receptores CD19 expressos de forma ubíqua nas células B.

Os anticorpos anti-CD27 ligam-se aos receptores CD27 expressos nas células B de memória e nas células plasmáticas plasmablastos.

Os anticorpos anti-CD38 ligam-se aos receptores CD38 expressos nas células plasmáticas plasmablastos.

Adicione um corante fluorescente de ligação ao DNA como marcador de células mortas.

As células mortas exibem uma perda de integridade da membrana, permitindo a entrada celular do corante e a ligação ao DNA de fita dupla; as células vivas permanecem sem coloração.

Centrifugue para remover anticorpos e corantes não ligados e ressuspender as células no tampão FACS. Filtre as células através de um filtro para obter uma suspensão homogênea e eliminar aglomerados.

Usando um citômetro de fluxo, separe as células mortas das vivas. Dentro das células vivas, a expressão de CD19, CD27 e CD38 distingue células B ingênuas, células B de memória e plasmócitos plasmablastos.

Depois de realizar o bloqueio não específico, adicione 1 micrograma de cada anticorpo de seleção por 1 x 10⁶ células ao tubo com mistura suave para uma incubação de 30 minutos no gelo. Durante os últimos cinco minutos da incubação, adicione 5 microlitros de 7-AAD às células. Em seguida, adicione 2 mililitros de PBS fresco às células e vortex antes de centrifugar.

Ressuspenda o pellet em um tampão de classificação fresco a uma concentração de 1 a 5 x 10⁷ células por mililitro e filtre as células através de um filtro de células de 40 mícrons em um novo tubo de poliestireno de 5 mililitros. Em seguida, classifique as células por citometria de fluxo em três tubos de 15 mililitros contendo 5 mililitros de meio RPMI fresco para coletar as células B virgens, células B de memória e plasmócitos plasmablastos.