Quantificação de mediadores inflamatórios em células derivadas de tecidos humanos infectados

Durante uma infecção, os linfócitos ativados liberam mediadores inflamatórios - citocinas - para provocar uma resposta imune.

Para quantificar os mediadores inflamatórios em um tecido infectado, comece com uma suspensão celular contendo células imunes derivadas do tecido pulmonar humano.

Incube as células com Haemophilus influenzae - uma bactéria patogênica respiratória. Os antígenos de superfície da bactéria interagem com receptores de reconhecimento de padrões em células imunes fagocíticas. Isso inicia a internalização da bactéria, o processamento em peptídeos menores e a apresentação do peptídeo pela molécula principal do complexo de histocompatibilidade.

A molécula antígeno-MHC-II nas células fagocíticas liga-se aos linfócitos T através dos receptores de células T, juntamente com interações co-estimulatórias do receptor, resultando na ativação de linfócitos T e na produção de citocinas pró-inflamatórias.

Trate as células com bloqueadores de Golgi, prejudicando a liberação de citocinas - causando seu acúmulo dentro das células. Lave as células com um tampão de bloqueio para bloquear locais de ligação não específicos.

Manchar a suspensão celular com uma mistura de anticorpos marcados com fluoróforo que se ligam especificamente aos marcadores de superfície de linfócitos T humanos, permitindo a marcação dos linfócitos.

Fixe as células e permeabilize-as com um surfactante formador de poros. Incube as células permeabilizadas com anticorpos anticitocinas marcados com fluoróforo, que entram nas células e interagem com citocinas específicas.

Usando citometria de fluxo, meça o sinal de fluorescência de citocinas dentro dos linfócitos marcados, correlacionando-se com a produção de mediadores inflamatórios devido à infecção bacteriana.

Corte cerca de 20 a 40 gramas da amostra de lobectomia em seções de 3 a 5 milímetros cúbicos. Coloque-os dentro de uma câmara estéril de 50 microlitros e fragmente mecanicamente o tecido usando um desagregador apropriado. Após a desagregação do tecido, lisar os glóbulos vermelhos conforme demonstrado e ressuspender as células em RPMI estéril. Em seguida, filtre as células através de uma malha de náilon estéril de 100 micrômetros e conte o número de células viáveis usando o método de exclusão de azul de tripano.

Para o ensaio de infecção, ressuspenda as células pulmonares em RPMI até uma concentração final de 4 milhões de células por mililitro por tubo. Em seguida, infecte as células em um MOI de 100 bactérias por célula. Afrouxe a tampa meia rotação para permitir a transferência de gás nos tubos. Coloque as células no rotador do tubo e incube-as a 37 graus Celsius, enquanto gira a 12 RPM. Uma hora após a estimulação, adicione Brefeldin A para evitar a exportação extracelular de citocinas e incube as suspensões celulares por mais 16 a 22 horas com rotação.

No dia seguinte, lavar a suspensão celular com 500 microlitros de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino e 0,01% de azida sódica. Em seguida, permaneça na suspensão celular para marcadores específicos de superfície celular de linfócitos humanos por uma hora. Em seguida, lave as células com PBS e fixe-as e permeabilize-as, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, incube as células com anticorpos intracelulares de coloração de citocinas por uma hora. Em seguida, lave as células e ressuspenda-as em 100 microlitros de PBS, antes da aquisição dos dados em um citômetro de fluxo.