Quantificação de interferons bioativos tipo I usando um ensaio repórter de fosfatase alcalina embrionária secretada

Para quantificar os interferons bioativos do tipo I, como interferon-alfa e interferon-beta, em uma amostra de teste, pegue uma placa de vários poços contendo células repórter projetadas. Essas células expressam a fosfatase alcalina embrionária secretada, SEAP, gene repórter sob o controle do promotor induzível por interferon-alfa e beta.

Adicionar a amostra de ensaio que contém uma concentração desconhecida de interferão de tipo I. Pipete uma variedade de concentrações de interferon tipo I humano para outros poços, que atuam como controles padrão. Incubar.

O interferon tipo I no poço de teste se liga a um receptor específico da superfície celular, ativando as Janus quinases. Essas proteínas quinases fosforilam transdutores de sinal e ativadores de proteínas de transcrição, STAT, que dimerizam e formam um complexo com um fator regulador de interferon específico.

Ao entrar no núcleo, o complexo se liga a uma sequência específica de DNA no promotor induzível por interferon-alfa e beta, ativando a transcrição do gene SEAP e produzindo as enzimas SEAP, que são secretadas no meio.

Transferir o meio contendo SEAP para poços de placas de vários poços com um substrato específico para SEAP. O SEAP hidrolisa o substrato rosa, produzindo um produto de cor azul-púrpura.

Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância do produto nos poços de teste e padrão, indicativo dos níveis de SEAP e da concentração de interferon tipo I.

A partir da curva padrão de interferão tipo I traçada, determinar a concentração de interferão tipo I bioactivo na amostra de ensaio.

Para medir o interferon tipo I bioativo usando células repórter de interferon-alfa / beta HEK-Blue, primeiro, coloque as células repórter em uma densidade de 50.000 células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços para um volume final de 180 microlitros. Em seguida, adicione 20 microlitros do sobrenadante de co-cultura recém-colhido a cada poço em duplicata. Inclua um conjunto de controles de padrão interno e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 18 a 22 horas.

Para determinar os níveis de fosfatase alcalina liberada pelas células repórteres, adicione 180 microlitros de solução QUANTI-Blue a cada poço de uma nova placa de fundo plano. Em seguida, adicione 20 microlitros dos sobrenadantes induzidos de células interferon-alfa/beta HEK-blue a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius até que a cor se desenvolva nos poços de controle de interferon padrão.

A solução QUANTI-Blue muda de rosa para azul-púrpura na presença da enzima. Finalmente, use um espectrofotômetro para avaliar os níveis de fosfatase alcalina secretada em 620 a 655 nanômetros e determine a concentração de interferon tipo I por extrapolação da parte linear da curva padrão do interferon.