Coloração de acetoximetil de calceína para avaliar a citotoxicidade mediada por células assassinas naturais em células cancerígenas

Para começar, pegue um tubo contendo células cancerígenas em meio sem soro para minimizar a interferência da esterase sérica durante o ensaio. Incubar com corante AM de calceína não fluorescente.

As esterases intracelulares ativas hidrolisam a calceína AM em corante de calceína fluorescente impermeável à membrana retido no citoplasma.

Células cancerígenas marcadas com calceína em placas e células NK efetoras nos poços de teste, enquanto os poços de controle contêm apenas células cancerígenas coradas com calceína sem células NK.

Os receptores de superfície celular ativadores das células NK se ligam aos ligantes ativadores nas células cancerígenas, formando uma sinapse imunológica. Essa ligação ativa a sinalização das células NK, polarizando os grânulos citotóxicos contendo perforinas e granzimas em direção à sinapse para liberação.

As perforinas formam os poros da membrana das células cancerígenas, facilitando a entrada celular das granzimas e iniciando a apoptose. A integridade da membrana comprometida causa vazamento de calceína fluorescente, reduzindo a fluorescência das células cancerígenas.

Capture imagens de fluorescência dos poços.

Um número reduzido de células cancerígenas vivas fluorescentes em poços contendo células NK do que em poços de controle indica citotoxicidade mediada por células NK em relação às células cancerígenas.

Para avaliar a citotoxicidade mediada por células NK usando AM de cálcio, após o crescimento de células de linha de células de câncer de fígado humano para uma confluência de 70% a 80%, conforme demonstrado, ressuspenda as células em 3 mililitros de DMEM sem soro e marque as células com 1,5 microlitros de solução AM de cálcio 10 milimolar por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, colete as células por centrifugação e lave as células duas vezes com 5 mililitros de PBS por lavagem.

Ressuspenda as células em uma concentração de 1 x 10⁵ células por mililitro de meio de cultura e adicione 100 microlitros de células a cada poço de uma placa de 96 poços em triplicata por condição de tratamento. Em seguida, adicione 1 x 10⁵ células NK humanas em 100 microlitros de meio de cultura a cada poço de células-alvo e coloque a placa na incubadora de cultura de células por quatro horas.

Após o término da incubação, capture pelo menos 10 campos diferentes de imagens das células positivas para cálcio AM para cada réplica de cada condição de tratamento em um microscópio de fluorescência com uma ampliação de 10 vezes. Em seguida, calcule a porcentagem de citotoxicidade usando a fórmula.