Um método aprimorado de imunoprecipitação de reticulação para identificação eficiente de RNA ligado a proteínas em testículos de camundongos

Pegue um testículo de camundongo recém-colhido em um tampão resfriado. Remova a túnica albugínea, a camada de tecido fibroso.

Triturar o testículo para liberar túbulos seminíferos contendo células germinativas e de Sertoli.

Adicione tampão e sujeite os túbulos à radiação UV para reticulação irreversível do RNA com as proteínas associadas, preservando as interações.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os túbulos em um tampão de lise contendo inibidores de RNase e protease.

Sonicar o tecido, liberando complexos proteína-RNA e outros componentes intracelulares. Os inibidores de RNase e protease inativam RNases e proteases endógenas.

Adicione DNase para degradar o DNA. Introduzir RNase diluída para digestão parcial do RNA.

Centrifugue e transfira o sobrenadante contendo complexos de RNA-proteína para uma solução de esferas magnéticas revestida com anticorpos com alta especificidade para a proteína alvo de ligação ao RNA.

Aplique um campo magnético para separar os complexos proteína-RNA ligados a contas. Descarte o sobrenadante.

Lave com tampão. Separe magneticamente os complexos proteína-RNA e use-os para análises adicionais de interação RNA-proteína.

Para iniciar este procedimento, colha cerca de 100 miligramas de testículos de camundongos de idade apropriada para cada experimento de imunoprecipitação. Coloque os lenços em PBS gelado. Usando uma pinça de ponta fina, remova suavemente a túnica albugínea. Adicione 3 mililitros de PBS gelado a um moedor de lenços de papel e use um pilão de vidro solto para triturar o tecido por uma leve força mecânica. Em seguida, transfira a suspensão de tecido para uma placa de cultura de células e adicione PBS gelado de até 6 mililitros. Agite o prato rapidamente para que o líquido cubra o fundo do prato uniformemente.

Reticule a suspensão no gelo três vezes com 400 milijoules por centímetro quadrado a 254 nanômetros. Certifique-se de misturar a suspensão entre cada irradiação e, em seguida, colete a suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 1.200 vezes g e a 4 graus por 5 minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mililitro de PBS. Depois disso, transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue a 1.000 vezes g e a 4 graus Celsius por dois minutos e descarte o sobrenadante.

Primeiro, adicione 125 microlitros de esferas magnéticas de proteína A por amostra a um tubo de centrífuga novo. Coloque o tubo no ímã para separar as esferas da solução. Após 10 segundos, remova o sobrenadante e lave as contas duas vezes com 1 mililitro de tampão de lise gelado. Ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de lise fria com 10 microgramas de anticorpo eCLIP. Gire os tubos em temperatura ambiente por 45 minutos e, em seguida, lave as contas duas vezes com 1 mililitro de tampão de lise gelado.

Para começar, ressuspenda os grânulos de tecido em 1 mililitro de tampão de lise fria contendo 22 microlitros de coquetel de inibidores de proteína 50X livres de EDTA e 11 microlitros de inibidor de RNAse. Continue lisando as amostras no gelo por 15 minutos. Sonicate cada amostra é descrita no protocolo de texto. Em seguida, adicione 4 microlitros de DNAse a cada tubo e misture bem. Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos enquanto agita a 1.200 RPM. Depois disso, adicione 10 microlitros de RNAse diluída e misture bem. Incube a 37 graus Celsius por 5 minutos enquanto agita a 1.200 RPM.

Em seguida, centrifugue a 15.000 vezes g e a 4 graus Celsius por 20 minutos para limpar o lisado. Colete cuidadosamente o sobrenadante. Primeiro, adicione 1 mililitro do lisado aos grânulos preparados e gire as amostras a 4 graus Celsius por duas horas ou durante a noite. Depois disso, colete as contas com o suporte magnético e descarte o sobrenadante. Lave as contas duas vezes com 900 microlitros de tampão com alto teor de sal e, em seguida, lave as contas duas vezes com 900 microlitros de tampão de lavagem.