Um método aprimorado de imunoprecipitação de reticulação para identificação eficiente de RNA ligado a proteínas em testículos de camundongos

Pegue um testículo de camundongo recém-colhido em um tampão resfriado. Remova a túnica albugínea, a camada de tecido fibroso.

Triturar o testículo para liberar túbulos seminíferos contendo células germinativas e de Sertoli.

Adicione tampão e sujeite os túbulos à radiação UV para reticulação irreversível do RNA com as proteínas associadas, preservando as interações.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os túbulos em um tampão de lise contendo inibidores de RNase e protease.

Sonicar o tecido, liberando complexos proteína-RNA e outros componentes intracelulares. Os inibidores de RNase e protease inativam RNases e proteases endógenas.

Adicione DNase para degradar o DNA. Introduzir RNase diluída para digestão parcial do RNA.

Centrifugue e transfira o sobrenadante contendo complexos de RNA-proteína para uma solução de esferas magnéticas revestida com anticorpos com alta especificidade para a proteína alvo de ligação ao RNA.

Aplique um campo magnético para separar os complexos proteína-RNA ligados a contas. Descarte o sobrenadante.

Lave com tampão. Separe magneticamente os complexos proteína-RNA e use-os para análises adicionais de interação RNA-proteína.

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