Um ensaio de código de barras para caracterização fenotípica e funcional de células imunes

Comece com amostras de teste contendo células imunes estimuladas e fixas.

A estimulação induz a expressão de marcadores específicos nas células, enquanto a fixação preserva marcadores fenotípicos, incluindo antígenos de superfície celular, e marcadores de estado funcional, incluindo citocinas.

Adicione uma combinação única de anticorpos conjugados com isótopos de metais pesados a cada amostra.

Essa técnica codifica várias amostras de forma exclusiva, distinguindo cada amostra por sua combinação de isótopos de metais pesados.

Os anticorpos se ligam a um epítopo comum, codificando todas as células das amostras.

Combine todas as amostras com código de barras em um único tubo, para processamento a jusante.

Adicione um coquetel de anticorpos conjugados com metal para corar os antígenos da superfície.

Adicione tampão de permeabilização para aumentar a permeabilidade da membrana celular para coloração intracelular.

Adicione outro conjunto de anticorpos conjugados com metal para corar citocinas intracelulares.

O código de barras permite a coloração e aquisição simultâneas das amostras agrupadas por citometria de massa. Essa técnica maximiza a eficiência do ensaio, melhorando a avaliação dos marcadores fenotípicos e funcionais do estado.

Para codificar as células fixas lisadas, descongele as amostras do armazenamento de menos 80 graus Celsius, lentamente no gelo. Dilua o buffer de perm de código de barras 10x com PBS em 1 a 10 e faça buffer suficiente para 3 mililitros por amostra.

Encha uma calha não estéril com CSM e outra com o buffer permanente de código de barras 1x. Em seguida, adicione 1 mililitro de CSM gelado às amostras recém-descongeladas. Misture bem e transfira para os respectivos tubos de polipropileno pré-rotulados.

Agora, pegue uma amostra de 10 microlitros e conte as células usando um contador de células automatizado. Normalize a contagem de células em cada tubo de cluster removendo o volume de células em excesso. Em seguida, centrifugue as células a 600 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células em 1 mililitro de tampão permanente de código de barras 1x com uma pipeta multicanal e centrifugue a 600 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente. Depois, aspire o sobrenadante.

Alinhe os tubos de cluster em um rack na mesma ordem indicada na chave do código de barras, para que a amostra corresponda ao seu código de barras. Adicione 800 microlitros de 1x buffer de perm de código de barras por pipeta multicanal a todas as amostras nos tubos do cluster, sem tocar no pellet celular para reduzir a perda celular.

Em seguida, reserve o rack com os tubos do cluster. Remova as tiras de tubo do kit de código de barras Palladium 20-plex de menos 20 graus Celsius e descongele em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de 1x buffer de perm de código de barras, misture bem e transfira 120 microlitros da mistura de código de barras ressuspensa para as amostras de células correspondentes nos tubos de cluster.

Misture bem por pipeta multicanal, para que não haja contaminação cruzada entre amostras com código de barras individual. Incube os tubos de cluster por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir que os códigos de barras rotulem as células. Após 30 minutos, centrifugar as amostras a 600 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda-os em 1 mililitro de CSM. Em seguida, centrifugue e ressuspenda novamente no CSM.

Em seguida, centrifugue a 600 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Com uma única pipeta e usando a mesma ponteira, transfira todos os pellets de células e cerca de 70 a 80 microlitros de volume residual para um tubo de poliestireno. Não ejete a ponta da pipeta. Separe a pipeta única com esta ponta.

Com uma pipeta multicanal e novas pontas, adicione 100 microlitros de CSM a cada tubo de cluster original para maximizar a recuperação celular. Usando a pipeta única com a ponta que foi reservada, transfira todos os pellets de células em 100 microlitros de volume residual para o mesmo tubo de poliestireno. Adicione CSM para completar o tubo de poliestireno em cerca de 3 mililitros. Conte e registre o número da célula do conjunto de códigos de barras agrupados. Em seguida, centrifugue a 600 vezes g por 5 minutos à temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Prossiga para a coloração das amostras com código de barras no mesmo dia.