Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da autoimunidade, como identificar anormalidades na frequência celular e diferenças de função, como a produção de citocinas-chave no cenário de doenças autoimunes. A principal vantagem desse método é que ele pode capturar um amplo repertório ou diferentes tipos de células e diferenças de função de uma amostra de sangue periférico facilmente obtida. Geralmente, os indivíduos novos nesse processo podem ter dificuldade em acertar o tempo das etapas de processamento do sangue, o design do painel de anticorpos, o próprio processo de código de barras e a análise de dados de células únicas de alta dimensão.

Essa abordagem de imunologia de sistemas é particularmente adequada para doenças autoimunes como o LES, onde a desregulação imunológica é generalizada e evidente no sangue periférico. A demonstração visual deste método é importante para esclarecer o tempo das etapas e também para mostrar como várias amostras podem ser codificadas com código de barras e agrupadas antes da análise de citometria de massa. Para iniciar este procedimento, coloque os tubos de poliestireno de fundo redondo rotulados de cinco condições diferentes para processamento de sangue total em um rack.

Em seguida, adicione um mililitro de 37 graus Celsius RPMI a cada tubo. Em seguida, adicione um mililitro de sangue total a cada tubo e pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar bem com o RPMI. Em seguida, adicione 10 microlitros de ruxolitinibe pré-diluído ao tubo rotulado como T seis mais cinco R e misture bem.

Coloque o rack de tubos na incubadora a 37 graus Celsius e comece a cronometrar a incubação. Para processar a amostra T zero, pipete todo o conteúdo do tubo T zero em um tubo cônico rotulado contendo 20 mililitros de tampão de lise/fixação de 37 graus Celsius na concentração de trabalho. Para otimizar a recuperação celular, enxágue o tubo com tampão lisoso/fixo e misture invertendo o tubo cônico.

Incube as células a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a lise e a fixação. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de PBS gelado para quebrar o pellet.

Em seguida, encha o tubo cônico até um volume de 15 mililitros com PBS. Em seguida, centrifugar as células a 500 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em um mililitro de CSM para quebrar o pellet.

Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga rotulado para coloração de anticorpos. Usando um contador de células automatizado, conte as células com uma amostra de 10 microlitros. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, aspire o sobrenadante, deixando o pellet em cerca de 60 microlitros de resíduo. Mantenha este pellet no gelo até que as amostras de outras condições tenham concluído o processamento. Em T igual a 30 minutos, transfira o suporte para tubos para a capa de cultura de tecidos.

Adicione 10 microlitros de R848 a 0,1 gramas por microlitro ao tubo T seis mais R848 e misture bem. Em seguida, adicione 10 microlitros de LPS a 0,01 microgramas por microlitro ao tubo T seis mais LPS e misture bem. Em seguida, adicione quatro microlitros de inibidor de transporte de proteínas aos tubos rotulados como T seis, T seis mais cinco R e T seis mais LPS e devolva as amostras à incubadora até que T seja igual a seis horas.

Misture bem as amostras com uma pipeta P1000 a cada duas horas. Em T igual a duas horas, adicione quatro microlitros de coquetel de inibidor de transporte de proteína ao tubo T seis mais R848. Misture todas as amostras e retorne o rack para a incubadora até que T seja igual a seis horas.

Em T igual a quatro horas, misture as amostras com uma pipeta P1000 mais uma vez. Em T é igual a seis horas, processe T seis, T seis mais LPS, T seis mais R848 e T seis mais cinco R tubos de amostra de sangue conforme descrito para a amostra T zero. Em seguida, armazene os pellets em volume CSM residual a menos 80 graus Celsius para processar mais tarde.

Para codificar as células fixas e lisadas, descongele as amostras do armazenamento de 80 graus Celsius negativos lentamente no gelo. Dilua o buffer de perm de código de barras 10X com PBS em um a 10 e faça buffer suficiente para três mililitros por amostra. Encha uma calha não estéril com CSM e outra com um buffer de permanente de código de barras X.

Em seguida, adicione um mililitro de CSM gelado às amostras recém-descongeladas, misture bem e transfira para os respectivos tubos de polipropileno pré-rotulados. Agora, pegue uma amostra de 10 microlitros e conte as células usando um contador de células automatizado. Normalize a contagem de células em cada tubo de cluster removendo o volume de células em excesso.

Em seguida, centrifugue as células a 600 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em um mililitro de um tampão permanente de código de barras X com uma pipeta multicanal e centrifugue a 600 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois, aspire o sobrenadante.

Alinhe os tubos de cluster em um rack na mesma ordem indicada na chave do código de barras para que a amostra corresponda ao seu código de barras. Adicione 800 microlitros de um tampão de perm de código de barras X por pipeta multicanal a todas as amostras nos tubos de cluster sem tocar no pellet celular para reduzir a perda de células. Em seguida, reserve o rack com os tubos do cluster.

Remova as tiras de tubo do kit de código de barras de paládio de 20 graus Celsius negativos e descongele em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de um tampão de perm de código de barras X, misture bem e transfira 120 microlitros da mistura de código de barras ressuspensa para as amostras de células correspondentes nos tubos de cluster. Misture bem com pipeta multicanal para que não haja contaminação cruzada entre amostras com código de barras individualmente.

Incube os tubos de cluster por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir que os códigos de barras rotulem as células. Após 30 minutos, centrifugar as amostras a 600 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante e suspenda-o novamente em um mililitro de CSM.

Em seguida, centrifugue e ressuspenda novamente no CSM. Em seguida, centrifugue a 600 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Com uma única pipeta e usando a mesma ponta, transfira todos os pellets celulares em cerca de 70 a 80 microlitros de volume residual para um tubo de poliestireno.

Não ejete a ponta da pipeta. Separe a pipeta única com esta ponta. Com uma pipeta multicanal e novas pontas, adicione 100 microlitros de CSM a cada tubo de cluster original para maximizar a recuperação celular.

Usando a pipeta única com a ponta que foi reservada, transfira todos os pellets de células em 100 microlitros de volume residual para o mesmo tubo de poliestireno. Adicione CSM para completar o tubo de poliestireno em cerca de três mililitros. Conte e registre o número da célula do conjunto de códigos de barras agrupados.

Em seguida, centrifugue a 600 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Prossiga para a coloração das amostras com código de barras no mesmo dia. Este esquema demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo alocação de alíquotas de amostra de sangue, tempo de adição de agentes de estimulação, coquetel de inibidores de transporte de proteínas e tempos de incubação até a lise e fixação dos glóbulos vermelhos.

A escolha dos agentes estimulantes dependerá das vias de sinalização e citocinas que são alvo de avaliação. Após a fixação e lise de hemácias, as amostras individuais de células fixas lisadas de um doador saudável foram codificadas com código de barras, marcadas com 26 anticorpos contra marcadores de superfície, permeabilizadas e coradas com 14 anticorpos contra citocinas. A estratégia limitada de gating que representa a identificação de monócitos CD14 altos é mostrada aqui.

Da esquerda para a direita, cada plotagem 2D representada é um subconjunto populacional da população pai que é fechada a partir da plotagem 2D imediatamente à esquerda. Usando monócitos CD14 altos como representantes em oito subconjuntos de células imunes, uma análise de citometria de massa foi realizada em amostras de sangue periférico de um doador saudável no tempo zero não estimulado e após estimulação com agonista TLR LPS e R848 e o ativador de células T PMA ionomicina. Um exemplo da indução de citocinas em monócitos CD14 altos é mostrado e citocinas selecionadas com especificidade para o agente estimulante utilizado são descritas.

R848 induz seletivamente a subunidade IL-12p40 e MCP1 em monócitos CD14 altos, enquanto o LPS não. Em contraste, a ionomicina PMA não induz citocinas em monócitos CD14 altos. Uma vez dominado, os estímulos sanguíneos podem ser feitos em cerca de sete horas e a etapa de código de barras pode ser feita em apenas cerca de uma hora.

Ao tentar este procedimento, é importante estar atento ao tempo das etapas e planejar com antecedência de acordo. Depois de implementar esse procedimento, você pode considerar alterar as condições de estimulação sanguínea no painel de citometria de massa para avaliar as respostas das células imunes específicas para seus próprios objetivos de pesquisa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter respostas de citocinas de amostras de sangue total e como agrupar várias amostras em um conjunto com código de barras para análise de citometria de massa.