Name: Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprenda a analisar imunofenótipos e citocinas em células únicas do sangue periférico usando citometria de massa. Este método permite estudar desregulação imune em doenças autoimunes com alta precisão.

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Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual e comentários úteis Aimee Pugh-Bernard. Este trabalho foi apoiado pelo Boettcher Fundação Webb-Waring Biomedical Research Award e prêmio número K23-1K23AR070897 do NIH para Elena W.Y. Hsieh. Ela também foi apoiada pelo prêmio número K12-HD000850 de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano e a Lucile Packard Foundation para saúde infantil, Stanford CTSA UL1 TR001085 e pesquisa de saúde infantil Instituto da Stanford University.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por o Colorado múltiplos institucional Review Board (COMIRB) da Universidade do Colorado. Todos os procedimentos descritos abaixo devem ser executados em uma capa de cultura de tecidos estéreis, salvo indicação em contrário, com pontas de pipetas filtrada, e todos os reagentes filtrada.
1. preparação dos reagentes para o processamento de sangue periférico
<ol><li>Prepare ruxolitinib estoque alíquotas (10 – 15 μL/frasco para uso individual) em 10mm diluindo o reagente liofilizado em DMSO, conforme as instruções do fabricante (loja a-80 ° C). Manter concentrações de DMSO em todos os ensaios, incluindo controles unstimulated inferior a 0,2% (vol/vol).</li>
	<li>Preparar R848 (resiquimod) alíquotas de estoque (10 – 15 μL/frasco para uso individual) em 1 μg/μL, diluindo o reagente liofilizado em água estéril como a instruções do fabricante. Loja a-80 ° C.</li>
	<li>Prepare lipopolissacarídeo (LPS) estoque partes alíquota (5 μL por frasco para um uso do tempo apenas) em 1 μg/μL diluindo o reagente liofilizado em água estéril, conforme as instruções do fabricante. Loja a-80 ° C.</li>
	<li>Prepare a célula coloração Media (CSM) usando PBS, 0,5% de BSA e 0,02% NaN3.</li>
	<li>Adquirir e manter pronto o coquetel de inibidor (PTI) de transporte de proteínas (Tabela de materiais).</li>
	<li>Descongelar e diluir o ruxolitinib frasco de estoque (10 mM) 01:10 em PBS estéril (1 mM). Reserve em temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos.</li>
	<li>Descongelar e diluir o frasco de estoque R848 (1 μg / µ l) 01:10 em PBS estéril (0,1 μg / µ l). Reserve em temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos.</li>
	<li>Descongelar e diluir o LPS frasco estoque 1: 100 (1 μg / µ l) em PBS estéril (0,01 μg / µ l). Reserve em temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos.</li>
	<li>Pré-aquecer o RPMI estéril (sem L-glutamina) num banho de água padrão 37 ° C (pelo menos 10 min).</li>
	<li>Dilua o buffer de lyse/correção de 1:5 em ddH filtrado2O (concentração de trabalho) sobre a bancada (não precisa ser estéril). Nota: 1 mL de sangue total requer 20 mL da concentração de trabalho de conserto/lyse buffer.<ol>
<li>Fazer reserva de lyse/fix para 5 condições de 1 mL de sangue total (pelo menos 100 mL cada). Alíquota 20ml da concentração trabalho de conserto/lyse buffer para tubos cónico de 50 mL por mililitro de sangue total (manter a solução de conserto/lyse a 37 ° C, até que seja necessário). Rotular as condições dos tubos cónicos contendo tampão lyse/correção da seguinte forma: T0 (tempo zero), T6 + 5R (tempo: 6 h com 5 hum ruxolitinib), T6 + R848 (tempo: 6 h com R848 de 1 μg/mL), T6 + LPS (tempo 6 h com 0,1 μg/mL de LPS), T6 (tempo: 6 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rótulo redondo fundo tubos de poliestireno estéril com tampas e tubos de microcentrifuga 1 mL com a mesma nomenclatura como na etapa 1.10.</li>
</ol>2. estimulação e processamento de sangue periférico (Figura 1)
<ol><li>Coloque o rotulado redondo fundo tubos de poliestireno da etapa 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) em um rack. Nota: Todas as etapas a seguir são realizadas neste tipo de tubo, a menos que especificado em contrário. Tampa os tubos ao transferir entre o capuz de cultura de tecidos e incubadora para manter a esterilidade.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 37 ° C RPMI (sem L-glutamina) para cada um dos tubos (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Inverter o tubo de coleta de sangue várias vezes, adicione 1 mL de sangue total a cada tubo e pipetar subindo e descendo várias vezes para homogeneizar com RPMI (diluição com RPMI impede a aglutinação do sangue durante o período de incubação de 6 h).</li>
	<li>Adicionar 10 μL das 01:10 ruxolitinib T6 + 5R. Misture bem com uma pipeta P1000. Coloque o suporte de tubos na incubadora a 37 ° C e iniciar a cronometragem da incubação (T = 0).</li>
	<li>Processe a amostra de T0 como segue.<ol>
<li>Pipete todo o conteúdo do tubo T0 para um tubo cónico rotulado contendo 20 mL de buffer de lyse/correção de concentração de trabalho 37 ° C. Para otimizar a recuperação celular, enxague o tubo com buffer de lyse/correção de concentração de trabalho. Misturar por inversão do tubo cónico.</li>
		<li>Incube a 37 ° C por 15 min permitir a Lise e fixação. Após fixação, execute todas as etapas subsequentes para a bancada. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Decante o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de PBS frio de gelo para romper a pelota e, em seguida, encha o erlenmeyer para um volume de 15 mL com PBS.</li>
		<li>Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Decante o sobrenadante. Repita a lavagem PBS (passos 2.4.3–2.4.4) se pelotas são vermelhas. Ressuspender as células em 1 mL de CSM para romper a pelota e, em seguida, transferir para o tubo rotulado microcentrifuga (passo 1.11) para anticorpos. Tome uma amostra de 10 µ l para contar células usando um contador de célula automatizada ou hemocytometer. Nota: Uma vez que todas as células são fixos neste ponto, não é necessário incluir uma mancha de viabilidade.</li>
		<li>Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante, deixando a pelota em ~ 60 µ l de volume residual. Mantenha esta pelota no gelo até amostras de outras condições completaram o tratamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em T = 30 min, tirar a grade de tubo (passo 2.3) para o bairro de cultura de tecidos e faça o seguinte.<ol>
<li>Adicionar 10 μL da 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Misture bem com uma pipeta P1000.</li>
		<li>Adicione 10 μL da 0,01 μg/μL LPS para T6 + LPS. Misture bem com uma pipeta P1000.</li>
		<li>Adicionar 4 μL de inibidor de transporte de proteína (estoque em 500 X) T6, T6 + 5R e T6 LPS (mas não a T6 + R848) e retornou as amostras para a incubadora até T = 6 h. mistura cuidadosamente com uma pipeta P1000 cada 2 h. Nota: R848 é um agonista TLR endoplasmic e, portanto, requer um atraso temporal na adição de inibidor de transporte da proteína para permitir o acesso para seu receptor-alvo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em T = 2 h, adicionar 4 μL de proteína inibidor de transporte cocktail (estoque em 500 X) para o T6 + R848 tubo. Misturar todas as amostras com uma pipeta P1000 e retornar a cremalheira para a incubadora até T = 6 h.</li>
	<li>Misturar as amostras com um P1000, mais uma vez em T = 4 h.</li>
	<li>Em T = 6 h, processo T6 T6 + LPS, T6 + R848 e T6 + 5R tubos de amostra de sangue, como descrito no passo 2.4 para a amostra de T0.</li>
	<li>Armazene as pelotas de célula no volume residual do CSM a-80 ° C para processar em uma data futura. Alternativamente, proceda ao código de barras e anticorpo que mancha sem armazenar.</li>
</ol>3. código de barras Lysed/fixo de células do sangue
<ol><li>Descongelar as amostras de células lysed/fixo do armazenamento-80 ° C lentamente no gelo; um máximo de 20 amostras pode ser etiquetado com código de barras único e agrupado usando este sistema. Diluir o buffer de perm X barcoding 10 de 01:10 com PBS; fazer suficiente buffer para ~ 3 mL por amostra.</li>
	<li>Encha uma calha não estéreis com o CSM e um com 1 buffer perm X barcoding. Adicione 1 mL de gelo frio CSM para amostras recém descongeladas, misture bem com uma pipeta e transferir para os tubos de respectivos pre-rotulada cluster polipropileno.</li>
	<li>Tome uma amostra μL 10 para contar células usando um contador de célula automatizada ou hemocytometer. Normalizar a contagem de células de 1,5 a 2 x 106 células por amostra em cada tubo de cluster: Remova e descarte o volume de células em excesso acima de 2 x 106 células.</li>
	<li>Centrifugar as células a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 1 mL de 1 buffer de perm X barcoding com uma pipeta multicanal e centrifugar 600 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Alinhe os tubos de cluster em um rack na mesma ordem, conforme indicado na chave de código de barras para a amostra corresponde com seu código de barras. Adicione 800 μL 1 X buffer de código de barras perm por pipeta multicanal para todas as amostras em tubos de cluster sem tocar o centrifugado com as pontas de pipeta (sem mistura) para reduzir a perda de células. Reserve o rack com os tubos de cluster.</li>
	<li>Remova 20-plex Pd Barcoding Kit tubo tiras de-20 ° C e descongelar à temperatura ambiente. Adicionar 100 μL de tampão, perm X barcoding 1, homogeneizar e transferir 120 μL da mistura ressuspensão de código de barras para as amostras de células correspondentes em tubos de cluster.</li>
	<li>Misture bem com uma pipeta multicanal para que não haja nenhuma contaminação cruzada entre amostras de código de barras individualmente. Incube os tubos de cluster por 30 min à temperatura ambiente para permitir que o código de barras rotular as células.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de CSM.</li>
	<li>Centrifugue e Resuspenda em CSM novamente como na etapa 3.8. Nota: Cada amostra agora é rotulada com um único código de barras, e as amostras estão prontas ser colocados em pool.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Com uma pipeta única e usando a mesma dica, transferir todos os chumbos de célula em ~ 70-80 volume residual μL para um tubo de poliestireno. Não ejetar a ponta da pipeta; Reserve a única pipeta com esta dica.</li>
	<li>Com uma pipeta multicanal e novas dicas, adicione ~ 100 μL CSM para cada tubo de cluster original para maximizar a recuperação celular. Com a pipeta única com a dica que foi reservada, transferi todos os chumbos de célula no volume residual do ~ 100 μL para o mesmo tubo de poliestireno.</li>
	<li>Adicione o CSM a parte de cima do tubo de poliestireno (~ 3 mL). Contagem e registo o número de células de código de barras em pool definem. Centrifugar a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Proceda à mancha as amostras de código de barras no mesmo dia. Nota: É normal esperar ~ 20-30% de perda de célula no processo de código de barras.</li>
</ol>4. coloração de código de barras Lysed/fixo as células do sangue e preparação para análise Cytometry massa instrumento
Nota: Cada 1 X título do anticorpo de coloração (1 μL do anticorpo por 100 μL de reação de coloração), geralmente pode manchar a 3 – 4 x 106 células. Portanto, quando todas as amostras de código de barras são agrupadas em um tubo, a quantidade de anticorpos deve ser ampliada. Se a quantidade de amostras de código de barras 20 a 30 x 106 células e cada 1 título X pode manchar 3 – 4 x 106 células, a amostra de código de barras requer apenas um 10 X título, em vez de individualmente, cada amostra de coloração que exigiria um 20 X quantidade de anticorpo (1 X por tubo individual). A concentração do anticorpo para o número do celular deverá ser titulada cuidadosamente para cada anticorpo individual cocktail (não discutido aqui).
<ol><li>Manche as células usando anticorpos (Tabela de materiais) para indução superfície de coloração e citocinas.<ol>
<li>Fazer a coloração da superfície coquetel pelo cálculo do montante a ser adicionado e contabilidade para pipetagem erro (i.e., se mancha 20 amostras de código de barras de 2 x 106 células em cada amostra, um 10 X mancha título é necessário; para cálculos de volume final, compensa erros de pipetagem, tornando um 10,5 X final solução de coloração).</li>
		<li>Adicione 10 X vale de superfície manchando o volume para o centrifugado de código de barras. Para reduzir a perda de células, com a mesma dica, misture e medir o volume de manchas superficiais e centrifugado.</li>
		<li>Com base no volume das células e cocktail de coloração, adicione CSM até um volume final de coloração de 50 μL por número de amostras de células (ou seja, se a execução de um conjunto de 20 amostras, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubar durante 30 min a 4 ° C. Agite a amostra cada 15 min para promover a coloração mesmo.</li>
		<li>Durante a incubação de superfície mancha, prepare o tampão de Perm/lavagem (Tabela de materiais) por diluição 01:10 com o ddH filtrado2O. Prepare volumes de 2ml de permeabilização e 5 mL para lavar. Manter a 4 ° C ou em gelo.</li>
		<li>Cubra a superfície de coloração do tubo com CSM e centrifugar 600 x g a 4 ° C por 5 min. Aspire o sobrenadante. Resuspenda a amostra de código de barras em 2 mL de 4 ° C, 01:10 tampão de diluição Perm/lavagem. Incube a 4 ° C por 20 a 30 min para permeabilize totalmente as células.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Para coloracao intracelular, siga os passos de coloração semelhantes (quanto a coloração da superfície). No entanto, usar a 4 ° C, 01:10 tampão de diluição Perm/lavagem em vez do CSM tornar-se o total de volume de coloração para que as células permanecem em um ambiente permeabilizing em toda a coloracao intracelular.</li>
		<li>Adicione o anticorpo intracelular cocktail à superfície manchada e permeabilizado centrifugado (passos 4.1.2–4.1.17). Trazer o total de volume de 50 μL por número de amostras de células de coloração. Incubar durante 60 min a 4 ° C. Agite a amostra cada 15 min para assegurar mesmo a coloração.</li>
		<li>Durante a coloracao intracelular, preparar a solução intercalador: 900 μL de PBS filtrado + 100 μL de filtrado 16% PFA (concentração final de 1,6% PFA) + 0,2 µ l de 500 hum de corante intercalador (Tabela de materiais).</li>
		<li>Acima do centrifugado + intracelular anticorpo cocktail com frio 01:10 tampão de lavagem/Perm.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante. Por cima do tubo de coloração com o CSM. Contar e registrar o número do celular. Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de solução de intercalador de passo 4.9. Incubar durante pelo menos 20 min em temperatura ambiente por completa intercalação, ou overnight a 4 ° C (amostras em solução intercalador podem ficar em 4 ° C por até 1 semana antes de executá-los no instrumento citometria em massa).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as células para o instrumento de citometria em massa.<ol>
<li>Por cima do tubo com 3 mL de filtrado ddH2O e centrifugar 600 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 3 mL de filtrado ddH2O. passar essa suspensão através de 100 μm filtro para remover quaisquer detritos ou agregados que potencialmente podem entupir o instrumento citometria em massa.</li>
		<li>Contagem e registro da pós-filtragem número de celular. Centrifugar a 600 x g por 5 min a 4 ° C</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de grânulo de calibração (Tabela de materiais), diluindo-01:10 em ddH filtrado2O.</li>
	<li>Ressuspender o manchado células no volume necessário de 01:10 diluído solução de grânulo de calibração para atingir uma concentração celular de ~ 1 x 106 células/mL. Nota: Para um CyTOF1 em 45 µ l/min, o ideal recomendado é 5 x 105 células/mL; para Helios em 30 µ l/min, 7,5 x 105 células/mL.</li>
	<li>Proceda para executar o exemplo no instrumento cytometry massa9.</li>
</ol>

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<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrevemos um romance, unicelulares, abordagem proteômica para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico "" plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. Este método emprega o sangue periférico como o veículo analítico e citometria de massa como a ferramenta para a avaliação de anormalidades fenotípicas e funcionais de celulares imunes. O método é prontamente aplicável a estudos de humanos e ratos<sup class="x...

As doenças auto-imunes são das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando 3-8% da população. Nos Estados Unidos, desordens auto-imunes estão entre as principais causas de morte entre as mulheres jovens e de meia-idade (idades < 65 anos)1,2. Doenças auto-imunes são caracterizadas por apresentação clínica heterogênea e diversos processos imunológicos subjacentes. O espectro da heterogeneidade está bem representado através de diferentes transtornos, tais como a participação conjunta em artrite reumatoide (ar) e doença neurológica em esclerose múltipla (MS). No entanto, este nível de heterogeneidade também é exemplificado dentro de um único distúrbio, tais como Lúpus eritematoso sistémico (SLE): alguns pacientes podem apresentar com patologia renal, enquanto outros sofrem de envolvimento hematológicas ou comum3.
A imunopatogênese subjacente em desordens auto-imunes espelha a heterogeneidade clínica, envolvendo autoe hiperativação de vários subconjuntos de célula imune inata e adaptativa e desregulação concomitante produção de citocinas. Enquanto citocinas desempenham um papel crucial na patogênese da doença auto-imune, compreender o seu papel específico no mecanismo da doença tem provado para ser um desafio. Citocinas são caracterizadas por pleiotropia (uma citocina pode ter vários efeitos sobre diferentes tipos de células), redundância (várias citocinas podem ter o mesmo efeito), a dualidade (uma citocina pode ter efeitos pro ou anti angentes sob condições diferentes), e plasticidade (citocinas podem ser moldadas em um papel diferente do seu "original", dependendo do ambiente)4,5,6. Consequentemente, métodos de nível populacional não consegue distinguir heterogêneas respostas celulares para a mesma "cytokine milieu". Da mesma forma, os projetos de estudo que se concentram em um aspecto específico do sistema imunológico (um único tipo de células ou citocinas), não oferecem uma avaliação global de todos os elementos envolvidos na complexa doença auto-imune. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas.
Recentemente, desenvolvemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico "" plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. O fluxo de trabalho descrito aqui é caracterizado pelo uso de amostras de sangue periférico intacto, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico isolado (PBMC). Sangue periférico representa o veículo fisiologicamente mais relevante para estudar a doença imune-mediada sistêmica, incluindo células de sangue 1) não-mononucleares frequentemente envolvidos em doenças autoimunes (isto é, neutrófilos, plaquetas) e 2) plasma circulantes de fatores, tais como ácidos nucleicos, complexos imunes e citocinas, que têm funções de ativação imunes. Para capturar o "intrínseco patogénicos" desregulação produção de citocinas, as amostras são processadas imediatamente após a recolha de sangue (T0, tempo zero) e após 6 horas de incubação a 37 ° C (temperatura do corpo fisiológico) com um transporte de proteína do sangue periférico inibidor na ausência de qualquer condição estimulante exógena (T6, tempo 6 h), para detectar a produção de citocinas (acumulação, T6-T0) que iria reflectir o estado de doença "intrínseco" (Figura 1). Para estudar os processos de desregulação que refletem sobre ou sob ativação da sinalização de caminhos envolvidos em respostas imunes pertinentes à doença, amostras de sangue periférico são tratados (incubação de 6 h a 37 ° C, com um inibidor de transporte de proteína) com uma exógena estimulando a condição que reflete a patogênese da doença, tais como agonistas do Receptor Toll-Like (TLR) no caso de SLE (T6 + R848, tempo 6 h com R848 de 1 µ g/mL), para detectar a produção de citocinas que refletisse uma resposta aos ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Para estudar os efeitos imunomoduladores de terapêutica disponível ex vivo, como dizem respeito aos processos de desregulação imune precisos para pacientes específicos, amostras de sangue periférico são tratadas com um inibidor JAK no relevantes terapêutico concentração (aqui, 5 hum ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6 h com 5 hum ruxolitinib), para detectar alterações no estado de doença "intrínseco" em resposta à droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Um inibidor JAK foi escolhido para este estudo porque inibidores JAK foram mostrados para ser bem sucedido no tratamento de doenças auto-imunes como Rá
Para avaliar simultaneamente os processos de desregulação descritos acima em vários subconjuntos de células imunes, amostras de sangue periférico de SLE pacientes e controles saudáveis foram processados conforme descrito acima e analisadas por citometria de massa. Citometria de massa, também conhecido como citometria-tempo-de-voo, oferece análises de célula única de mais de 40 parâmetros sem problemas de espectral se sobrepõem7,8,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de terra rara na forma de íons metálicos solúveis como tags vinculados aos anticorpos, ao invés de fluorophores10. Detalhes adicionais sobre a plataforma tecnológica de citometria em massa (ou seja, ajuste e calibração, aquisição de amostra) podem ser encontrados em Leipold et al e McCarthy et al 11 , 12 a alta-dimensionalidade da citometria de massa permite a medição simultânea de várias citocinas ao longo de subconjuntos de célula imune inata e adaptativa com granularidade de célula única (Tabela de materiais).
Parâmetros clínicos e laboratoriais convencionais atuais muitas vezes não são sensível ou específico o suficiente para a detecção de atividade da doença em curso ou a resposta de imunomoduladores específico13, refletindo a necessidade de melhor delinear o imunológico subjacente mudanças que impulsionam a flare-ups. Dada a abrangência do cytokine dysregulation na doença auto-imune, tem uma infinidade de abordagens de tratamento que usam anticorpos ou inibidores moleculares pequenos direcionamento citocinas ou sinalização de proteínas envolvidas na regulação da produção de citocinas recentemente surgiram. No seu formato básico, a abordagem analítica de sangue periférico, descrita aqui fornece uma plataforma para identificar subconjuntos de células específicas do paciente prejudicado e sua produção de citocina anormal na doença auto-imune com manifestações sistêmicas. Esta metodologia permite a personalização de opções terapêuticas como citocinas desregulação específicos podem ser identificadas, e tratamento específico, as opções podem ser testadas ex vivo para avaliar sua capacidade de immunomodulate a paciente doença específica processo.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinibe</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Estoque Conc: 10 mM; Conc final: 5 &mu; M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Stock Conc: 1 &mu; g/&mu; L; Conc Final: 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Teor de Estoque: 1 &mu; g/&mu; L; Conc final: 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Estéril PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix Buffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Stock Conc: 5X; Conc Final: 1X (diluir em ddH2O)</td></tr><tr><td>BD Phosflow buffer de perm/lavagem I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Conc de Estoque: 10X; Conc final: 1:10 (diluído em ddH2O)</td></tr> <tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio (NaN3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Conc de estoque: >99,9%; Conc Final: 0.0002</td></tr><tr><td>Inibidor de Transporte de Proteína (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Conc de Estoque: 500X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>DNA Intercalator</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Stock Conc: 500 &mu; M; Conc final: 0.1 &mu; </td></tr><tr><td>Meios de coloração de células M (CSM)</td><td></td><td></td> <td>PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barcode Perm</td><td>Buffer Fluidigm</td><td>201057</td><td>Stock Conc: 10X; Conc Final: 1X</td></tr><tr><td>Conjunto de Código de Barras Pd 20-plex</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Conc de Estoque: n/a; Cálculo Final: n/a</td></tr><tr><td>EQ TM Quatro Elementos Calibração de Esferas</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Cálculo de Estoque: 10X; Conc Final: 1X</td></tr><tr><td>Solução de Formaldeído Livre de MeOH a 16%</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>Conc de Estoque: 16% (p/v); Conc final: 1,6% (p/v)</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fundo redondo estéril</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Conc de stock: n/a; Conc Final: n/a</td></tr><tr><td>Tubos de cluster de polipropileno</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Conc de estoque: n/a; Conc final: n/a</td></tr><tr><td>Helios Instrumento CyTOF</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>Todas as soluções a serem usadas na análise CyTOF precisam estar livres de contaminação por metais. ddH2O é usado na preparação de qualquer solução deve ter uma resistividade de pelo menos 18,0 M&Omega;. cm. ddH2O e quaisquer soluções preparadas pelo próprio devem ser armazenadas em novos frascos de plástico ou vidro que nunca tenham sido autoclavados.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos usados para citometria de massa<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Marcadores de superfície</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Massa: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Massa: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Massa: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Massa: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Massa: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Massa: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>Massa: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Massa: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Massa: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Massa: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Massa: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Massa: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Massa: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Massa: 172</td></tr><tr><td>CD45 total</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>Massa: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Massa: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Massa: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Massa: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Massa: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Massa: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Massa: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Massa: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Massa: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Massa: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Massa: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Massa: 167</td></tr><tr><td><forte>Citocinas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&alfa;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Massa: 147</td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Biolenda&nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>Massa: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>AS17</td><td>Massa: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Massa: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Massa: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>Massa: 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>BL168</td><td>Massa: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Massa: 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>Massa: 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>Massa: 170</td></tr><tr><td>IFN&alpha;</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>Massa: 175</td></tr><tr><td>IFN&gama;</td><td>Biolegend</td><td>4S. B3</td><td>Massa: 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>Massa: 159</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Massa: 166</td></tr><tr><td>Nota: Se o fabricante for declarado como Fluidigm, este anticorpo foi adquirido da Fluidigm com metal pré-conjugado. Se o fabricante for declarado como diferente do Fluidigm, este anticorpo foi autoconjugado usando a rotulagem MaxPar Multi-Metal&nbsp; Kit (Fluidigm Cat: 201300) de acordo com o protocolo do fabricante.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Citocinas desempenham um papel crucial na patogênese de doenças auto-imunes. Daí, a medição dos níveis de citocina tem sido o foco de vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos precisos que levam ao colapso da auto-tolerância e auto-imunidade subsequente. Abordagens, até agora tem sido baseadas no estudo de um aspecto específico do sistema imunológico (um único ou alguns tipos de células ou citocinas) e não oferecer uma avaliação global da doença auto-imune complexa. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas. Uma abordagem abrangente de célula única para avaliar a produção de citocinas em vários subconjuntos de células imunes, dentro do contexto de "intrínseco" plasma paciente específico, fatores, de circulação é descrita aqui. Esta abordagem permite a monitoração do paciente específico imune fenótipo (marcadores de superfície) e função (citocinas), quer na sua nativa "intrínseco patogénicos" doença estadual, ou na presença de agentes terapêuticos (em vivo ou ex vivo).

A Figura 1 demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo a alocação das alíquotas de amostra de sangue, sincronismo da adição de agentes de estimulação, proteína de transporte inibidor cocktail e incubação vezes até o lysis da pilha de sangue vermelha (RBC) e fixação. A escolha dos agentes estimulantes dependerá as vias de sinalização e citocinas que são direcionadas para a avaliação. Por exemplo...

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da autoimunidade, como identificar anormalidades na frequência celular e diferenças de função, como a produção de citocinas-chave no cenário de doenças autoimunes. A principal vantagem desse método é que ele pode capturar um amplo repertório ou diferentes tipos de células e diferenças de função de uma amostra de sangue periférico facilmente obtida. Geralmente, os indivíduos novos nesse processo podem ter dificuldade em acertar o tempo das etapas de processamento do sangue, o design do painel de anticorpos, o próprio processo de código de barras e a análise de dados de células únicas de alta dimensão.Essa abordagem de imunologia de sistemas é particularmente adequada para doenças autoimunes como o LES, onde a desregulação imunológica é generalizada e evidente no sangue periférico. A demonstração visual deste método é importante para esclarecer o tempo das etapas e também para mostrar como várias amostras podem ser codificadas com código de barras e agrupadas antes da análise de citometria de massa. Para iniciar este procedimento, coloque os tubos de poliestireno de fundo redondo rotulados de cinco condições diferentes para processamento de sangue total em um rack.Em seguida, adicione um mililitro de 37 graus Celsius RPMI a cada tubo. Em seguida, adicione um mililitro de sangue total a cada tubo e pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar bem com o RPMI. Em seguida, adicione 10 microlitros de ruxolitinibe pré-diluído ao tubo rotulado como T seis mais cinco R e misture bem.Coloque o rack de tubos na incubadora a 37 graus Celsius e comece a cronometrar a incubação. Para processar a amostra T zero, pipete todo o conteúdo do tubo T zero em um tubo cônico rotulado contendo 20 mililitros de tampão de lise/fixação de 37 graus Celsius na concentração de trabalho. Para otimizar a recuperação celular, enxágue o tubo com tampão lisoso/fixo e misture invertendo o tubo cônico.Incube as células a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a lise e a fixação. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de PBS gelado para quebrar o pellet.Em seguida, encha o tubo cônico até um volume de 15 mililitros com PBS. Em seguida, centrifugar as células a 500 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em um mililitro de CSM para quebrar o pellet.Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga rotulado para coloração de anticorpos. Usando um contador de células automatizado, conte as células com uma amostra de 10 microlitros. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, aspire o sobrenadante, deixando o pellet em cerca de 60 microlitros de resíduo. Mantenha este pellet no gelo até que as amostras de outras condições tenham concluído o processamento. Em T igual a 30 minutos, transfira o suporte para tubos para a capa de cultura de tecidos.Adicione 10 microlitros de R848 a 0,1 gramas por microlitro ao tubo T seis mais R848 e misture bem. Em seguida, adicione 10 microlitros de LPS a 0,01 microgramas por microlitro ao tubo T seis mais LPS e misture bem. Em seguida, adicione quatro microlitros de inibidor de transporte de proteínas aos tubos rotulados como T seis, T seis mais cinco R e T seis mais LPS e devolva as amostras à incubadora até que T seja igual a seis horas.Misture bem as amostras com uma pipeta P1000 a cada duas horas. Em T igual a duas horas, adicione quatro microlitros de coquetel de inibidor de transporte de proteína ao tubo T seis mais R848. Misture todas as amostras e retorne o rack para a incubadora até que T seja igual a seis horas.Em T igual a quatro horas, misture as amostras com uma pipeta P1000 mais uma vez. Em T é igual a seis horas, processe T seis, T seis mais LPS, T seis mais R848 e T seis mais cinco R tubos de amostra de sangue conforme descrito para a amostra T zero. Em seguida, armazene os pellets em volume CSM residual a menos 80 graus Celsius para processar mais tarde.Para codificar as células fixas e lisadas, descongele as amostras do armazenamento de 80 graus Celsius negativos lentamente no gelo. Dilua o buffer de perm de código de barras 10X com PBS em um a 10 e faça buffer suficiente para três mililitros por amostra. Encha uma calha não estéril com CSM e outra com um buffer de permanente de código de barras X.Em seguida, adicione um mililitro de CSM gelado às amostras recém-descongeladas, misture bem e transfira para os respectivos tubos de polipropileno pré-rotulados. Agora, pegue uma amostra de 10 microlitros e conte as células usando um contador de células automatizado. Normalize a contagem de células em cada tubo de cluster removendo o volume de células em excesso.Em seguida, centrifugue as células a 600 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em um mililitro de um tampão permanente de código de barras X com uma pipeta multicanal e centrifugue a 600 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois, aspire o sobrenadante.Alinhe os tubos de cluster em um rack na mesma ordem indicada na chave do código de barras para que a amostra corresponda ao seu código de barras. Adicione 800 microlitros de um tampão de perm de código de barras X por pipeta multicanal a todas as amostras nos tubos de cluster sem tocar no pellet celular para reduzir a perda de células. Em seguida, reserve o rack com os tubos do cluster.Remova as tiras de tubo do kit de código de barras de paládio de 20 graus Celsius negativos e descongele em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de um tampão de perm de código de barras X, misture bem e transfira 120 microlitros da mistura de código de barras ressuspensa para as amostras de células correspondentes nos tubos de cluster. Misture bem com pipeta multicanal para que não haja contaminação cruzada entre amostras com código de barras individualmente.Incube os tubos de cluster por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir que os códigos de barras rotulem as células. Após 30 minutos, centrifugar as amostras a 600 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante e suspenda-o novamente em um mililitro de CSM.Em seguida, centrifugue e ressuspenda novamente no CSM. Em seguida, centrifugue a 600 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Com uma única pipeta e usando a mesma ponta, transfira todos os pellets celulares em cerca de 70 a 80 microlitros de volume residual para um tubo de poliestireno.Não ejete a ponta da pipeta. Separe a pipeta única com esta ponta. Com uma pipeta multicanal e novas pontas, adicione 100 microlitros de CSM a cada tubo de cluster original para maximizar a recuperação celular.Usando a pipeta única com a ponta que foi reservada, transfira todos os pellets de células em 100 microlitros de volume residual para o mesmo tubo de poliestireno. Adicione CSM para completar o tubo de poliestireno em cerca de três mililitros. Conte e registre o número da célula do conjunto de códigos de barras agrupados.Em seguida, centrifugue a 600 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Prossiga para a coloração das amostras com código de barras no mesmo dia. Este esquema demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo alocação de alíquotas de amostra de sangue, tempo de adição de agentes de estimulação, coquetel de inibidores de transporte de proteínas e tempos de incubação até a lise e fixação dos glóbulos vermelhos.A escolha dos agentes estimulantes dependerá das vias de sinalização e citocinas que são alvo de avaliação. Após a fixação e lise de hemácias, as amostras individuais de células fixas lisadas de um doador saudável foram codificadas com código de barras, marcadas com 26 anticorpos contra marcadores de superfície, permeabilizadas e coradas com 14 anticorpos contra citocinas. A estratégia limitada de gating que representa a identificação de monócitos CD14 altos é mostrada aqui.Da esquerda para a direita, cada plotagem 2D representada é um subconjunto populacional da população pai que é fechada a partir da plotagem 2D imediatamente à esquerda. Usando monócitos CD14 altos como representantes em oito subconjuntos de células imunes, uma análise de citometria de massa foi realizada em amostras de sangue periférico de um doador saudável no tempo zero não estimulado e após estimulação com agonista TLR LPS e R848 e o ativador de células T PMA ionomicina. Um exemplo da indução de citocinas em monócitos CD14 altos é mostrado e citocinas selecionadas com especificidade para o agente estimulante utilizado são descritas.R848 induz seletivamente a subunidade IL-12p40 e MCP1 em monócitos CD14 altos, enquanto o LPS não. Em contraste, a ionomicina PMA não induz citocinas em monócitos CD14 altos. Uma vez dominado, os estímulos sanguíneos podem ser feitos em cerca de sete horas e a etapa de código de barras pode ser feita em apenas cerca de uma hora.Ao tentar este procedimento, é importante estar atento ao tempo das etapas e planejar com antecedência de acordo. Depois de implementar esse procedimento, você pode considerar alterar as condições de estimulação sanguínea no painel de citometria de massa para avaliar as respostas das células imunes específicas para seus próprios objetivos de pesquisa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter respostas de citocinas de amostras de sangue total e como agrupar várias amostras em um conjunto com código de barras para análise de citometria de massa.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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