Medição in vitro da atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida

A α-galactosidase A e a α-glicosidase ácida são enzimas lisossômicas cruciais para o metabolismo celular.

A α-galactosidase A decompõe substratos como glicolipídios, enquanto a α-glicosidase ácida hidrolisa o glicogênio.

Para medir sua atividade enzimática in vitro, pegue poços de placas de vários poços com amostras contendo concentrações conhecidas de α-galactosidase A e α-glicosidase ácida, respectivamente.

Adicione o volume necessário de soluções ácidas de substratos sintéticos de 4-metilumbeliferilo aos poços, substratos fluorogênicos específicos projetados para imitar substratos naturais para essas enzimas.

Incubar no escuro.

As enzimas α-galactosidase A e α-glicosidase ácida clivam seus respectivos substratos, liberando o produto fluorescente, 4-metilumbeliferona.

Adicione um tampão alcalino para encerrar a reação enzimática.

Usando um leitor de fluorescência de microplacas, medir a intensidade de fluorescência da 4-metilumbeliferona nos poços, indicativa de sua concentração, para determinar a atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida, respectivamente.

Diluir a quantidade calculada de cada amostra e pipetá-la para tubos de reação frescos de 1,5 mililitros para obter 0,05 microgramas de alfa-galactosidase A ou 0,5 microgramas de alfa-glicosidase ácida por microlitro de solução. Vortex as amostras por 5 segundos novamente e pipetar 10 microlitros dessa diluição e duplicar em uma placa de 96 poços.

Inicie as reações adicionando 20 microlitros da respectiva solução de substrato. Para alfa-galactosidase A, adicione 2 milimolares de 4-metilumbeliferil-alfa-D-galactopiranosídeo ou 4-MU-Gal em tampão citrato de fosfato 0,06 molar, pH 4,7. Para alfa-glicosidase ácida, adicione 2 milimolares de 4-metilumbeliferil-alfa-D-glicopiranosídeo ou 4-MU-Glu em acetato de sódio 0,025 molar, pH 4,0.

Incubar as reações enzimáticas por 1 hora no escuro a 37 graus Celsius e 300 RPM em um agitador orbital. Em seguida, termine a reação adicionando 200 microlitros de tampão de hidróxido de sódio glicina ajustado com pH 1,0 molar 10,5. Prepare uma curva padrão de 4-MU a partir de um estoque de 0,01 miligrama por mililitro de acordo com o protocolo de texto e pipete 10 microlitros das soluções em duplicata em uma placa de 96 poços.

Adicione 200 microlitros do tampão de hidróxido de sódio de glicina molar 1,0 a cada poço para ajustar o volume e o pH. Por fim, meça a atividade enzimática em um leitor de fluorescência equipado com o conjunto de filtros apropriado e analise os dados usando o software apropriado para o dispositivo leitor de fluorescência.