Medição in vitro da atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida

A α-galactosidase A e a α-glicosidase ácida são enzimas lisossômicas cruciais para o metabolismo celular.

A α-galactosidase A decompõe substratos como glicolipídios, enquanto a α-glicosidase ácida hidrolisa o glicogênio.

Para medir sua atividade enzimática in vitro, pegue poços de placas de vários poços com amostras contendo concentrações conhecidas de α-galactosidase A e α-glicosidase ácida, respectivamente.

Adicione o volume necessário de soluções ácidas de substratos sintéticos de 4-metilumbeliferilo aos poços, substratos fluorogênicos específicos projetados para imitar substratos naturais para essas enzimas.

Incubar no escuro.

As enzimas α-galactosidase A e α-glicosidase ácida clivam seus respectivos substratos, liberando o produto fluorescente, 4-metilumbeliferona.

Adicione um tampão alcalino para encerrar a reação enzimática.

Usando um leitor de fluorescência de microplacas, medir a intensidade de fluorescência da 4-metilumbeliferona nos poços, indicativa de sua concentração, para determinar a atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida, respectivamente.

Diluir a quantidade calculada de cada amostra e pipetá-la para tubos de reação frescos de 1,5 mililitros