Purificação de nanopartículas de proteínas automontáveis usando cromatografia de afinidade

Pegue uma suspensão de bactérias modificadas que expressam nanopartículas de proteína recombinantes de automontagem com etiquetas de poli-histidina.

Sonicar para liberar componentes intracelulares.

Centrifugue para coletar o sobrenadante contendo nanopartículas de proteína. Dilua-o com um tampão sem imidazol.

Pegue uma coluna de cromatografia de afinidade contendo grânulos de agarose com cátions de níquel imobilizados.

Adicione um tampão com baixa concentração de imidazol para equilíbrio da coluna.

Adicione o lisado bacteriano à coluna.

Durante a corrida, a poli-histidina nas nanopartículas de proteína se liga fortemente aos cátions de níquel.

Enquanto isso, contaminantes como lipopolissacarídeos bacterianos e outras proteínas se ligam fracamente à coluna.

Lave com um tampão contendo uma baixa concentração de imidazol para remover as proteínas fracamente ligadas.

Introduza isopropanol para remover os lipopolissacarídeos e depois lave.

Em seguida, introduza um tampão com uma concentração intermediária de imidazol. O imidazol compete com a histidina pela ligação ao cátion níquel, liberando nanopartículas de proteínas ligadas.

Em seguida, adicione um tampão contendo uma alta concentração de imidazol para eluir completamente as nanopartículas de proteína.

Colete as nanopartículas de proteína purificadas para aplicação posterior.

Para a lise de E. coli colhida expressando o feixe de seis hélices SAPN, use uma sonda com uma saída de sonicação de 150 watts, com quatro segundos de sonicação e seis segundos de repouso para sonicar pastilhas bacterianas ressuspensas em 40 mililitros de tampão livre de imidazol em gelo por cinco minutos.

Centrifugar o lisado celular para gerar um sobrenadante clarificado e transferi-lo para um balão estéril de 150 mililitros. Em seguida, leve a amostra até um volume final de 100 mililitros com tampão fresco sem imidazol.

Para isolar a proteína de interesse, abra o software FPLC e clique na opção Novo Método. No menu Configurações do método, abra o menu suspenso Posição da coluna e selecione Porta C1 3. No menu suspenso Mostrado por técnica, selecione Afinidade. No menu suspenso Tipo de coluna, selecione Outros, HisTrap HP e cinco mililitros. O volume da coluna e as caixas de pressão serão automaticamente ajustados para os valores apropriados.

Clique em Estrutura de Tópicos do Método e arraste os botões Equilíbrio e Aplicação de Amostra, três botões Lavagem de Colunas e o botão Eluição do menu pop-up Biblioteca de Fases ao lado da seta, antes de fechar o menu Biblioteca de Fases. Clique em Equilíbrio e defina os valores listados na tabela como Buffer inicial B, 4%, Buffer final B, 4% e Volume da coluna, 5.

Clique em Aplicativo de Amostra. Na caixa Carregamento de amostra, clique no botão de opção para Injetar amostra na coluna com bomba de amostra e confirme se a caixa ao lado de Usar taxa de fluxo das configurações do método está marcada na Injeção de amostra com caixa de bomba do sistema. Altere o valor da caixa Volume para 100 mililitros e o Esquema de Coleta de Frações para Habilitar.

Desmarque a caixa Usar tamanho da fração nas configurações do método e altere o tamanho da fração para quatro mililitros. Clique no primeiro botão Lavagem de coluna. Defina os valores listados na tabela como Buffer inicial B, 4%, Buffer final B, 4% e Volume da coluna, 10. Clique na caixa Ativar esquema de coleta de frações e desmarque a opção Usar tamanho da fração para configurações de método. Altere o tamanho da fração para quatro mililitros e clique no segundo botão Lavagem de coluna.

Defina os valores na tabela como Buffer inicial B, 0%, Buffer final B, 0% e Volume da coluna, 5. Clique na caixa Ativar esquema de coleta de frações e desmarque a opção Usar tamanho da fração em Configurações do método. Altere o tamanho da fração para 4 mililitros e clique no botão Lavagem da terceira coluna. Defina os valores na tabela como Buffer inicial B, 0%, Buffer final B, 0% e Volume da coluna, 10. Clique no botão Ativar esquema de coleta de frações e desmarque a caixa Usar tamanho de fração para configurações de método. Em seguida, altere o tamanho da fração para 4 mililitros.

Clique no botão Eluição e clique com o botão direito do mouse nas informações da tabela. No menu pop-up, clique em Excluir Etapa e arraste o botão Gradiente Isocrático para a tabela duas vezes para que haja duas entradas. Defina o valor da primeira entrada como Buffer Inicial B, 30%, Buffer Final B, 30% e Volume da Coluna, 10.

Defina o valor da segunda entrada como Buffer inicial B, 100%, Buffer final B, 100% e volume da coluna, 10. Clique no botão Ativar esquema de coleta de frações e clique na caixa Usar tamanho de fração para configurações de método. Em seguida, clique em Salvar como e nomeie o arquivo como Purificação.

Coloque a tubulação A da bomba do FPLC no tampão de lavagem sem imidazol e a tubulação B da bomba no tampão imidazol 500 milimolar. Coloque a tubulação da bomba de amostra na amostra de 100 mililitros e execute o programa de purificação. Quando a lavagem com isopropanol a 60% for necessária, pause o programa, mova a tubulação da bomba da lavagem sem imidazol para a lavagem com isopropanol a 60% e reinicie o programa. No final da lavagem, pause o programa novamente, retorne a tubulação A da bomba para o tampão de lavagem sem imidazol e reinicie o programa de purificação.