Desenvolvendo uma cocultura de neurônios e macrófagos in vitro

Comece com neurônios do gânglio da raiz dorsal murina isolados em um meio de crescimento.

Semeie-os em uma placa de vários poços revestida de polímero para promover a ligação neuronal.

Em seguida, pegue um camundongo dissecado sacrificado e injete PBS gelado em sua cavidade peritoneal.

Massageie suavemente o peritônio para desalojar os macrófagos da parede do peritônio.

Aperte o camundongo para coletar o fluido peritoneal e trate-o com um tampão de lise para lisar seletivamente os glóbulos vermelhos, que aparecem como contaminantes. Centrifugue e ressuspenda as células em um meio de cultura.

Transfira os macrófagos para uma inserção porosa posicionada dentro do poço contendo os neurônios cultivados.

Essa co-cultura permite que neurônios e macrófagos estejam próximos.

Trate a co-cultura com db-cAMP e incube para facilitar sua entrada nas células. Isso ativa os neurônios para secretar as moléculas de sinalização.

Essas moléculas de sinalização, juntamente com o db-cAMP, induzem os macrófagos a adotar um fenótipo pró-regenerativo e secretam fatores essenciais para o crescimento neuronal.

Antes de montar a cultura, pré-cubra uma placa de 6 poços com poli-D-lisina e laminina. Em seguida, incube a placa de 6 poços com 0,01 poli-D-lisina a 37 graus Celsius por duas horas ou a 4 graus Celsius durante a noite. Depois disso, lave o prato duas vezes com água destilada.

Em seguida, incubar a placa com solução de laminina na concentração de 3 microgramas por mililitro durante duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave o prato duas vezes com água destilada e seque o prato em temperatura ambiente por pelo menos uma hora.

Agora, incise a pele que cobre a coluna vertebral de um camundongo sacrificado com uma lâmina cirúrgica e disseque os músculos paravertebrais bilateralmente para expor os ossos vertebrais. Remova os ossos vertebrais meticulosamente usando uma ronda cirúrgica de ponta estreita até que o DRG esteja totalmente exposto.

Sob um microscópio de dissecação, remova o DRG bilateralmente de S1 até o nível C1 usando tesoura de iridectomia e pinça de ponta fina. Transfira o DRG para um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro usando uma ponta de pipeta azul com uma extremidade cortada.

Em seguida, remova o DMEM após uma centrifugação rápida por vários segundos usando uma minicentrífuga. Adicione 1 mililitro de DMEM contendo 125 unidades por mililitro de colagenase tipo 11 e incube o tubo por 90 minutos com uma rotação suave usando uma torção ou agitador a 37 graus Celsius.

Em seguida, descarte o DMEM contendo colagenase e adicione 1 mililitro de DMEM fresco. Transfira o DRG para um tubo cônico de 15 mililitros usando uma ponta de pipeta azul com uma extremidade cortada. Em seguida, pipete para cima e para baixo suavemente, pelo menos, 15 vezes para fazer uma suspensão celular homogênea.

Centrifugar o tubo a 239 g durante três minutos e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante com detritos flutuantes. Adicione 1 mililitro de meio neurobasal suplementado com B27 e ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo cinco a 10 vezes.

Em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 micrômetros sobreposto a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, coloque todos os neurônios DRG coletados em dois poços da placa de 6 poços.

Para preparar macrófagos peritoneais primários de um camundongo adulto, faça uma incisão delicada na pele abdominal para expor o peritônio e evite cortar o peritônio para evitar vazamento de fluido de lavagem.

Em seguida, perfure o peritônio usando uma seringa com uma agulha de calibre 22 e injete 10 mililitros de PBS gelado na cavidade peritoneal. Massageie suavemente o peritônio por um a dois minutos. Em seguida, retire a agulha e esprema o PBS através do local da punção da agulha e colete o fluido de lavagem em um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, centrifugue o fluido de lavagem a 239 g por 10 minutos a 4 graus Celsius para pellet os componentes celulares. Em seguida, ressuspenda o pellet com 3 mililitros do tampão de lise dos glóbulos vermelhos por três minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, centrifugue novamente a suspensão celular a 239 g durante 10 minutos a 4 graus Celsius. Ressuspenda as células peletizadas em 1 mililitro de meio B27 neurobasal. Placa metade de todos os macrófagos coletados em um inserto de cultura de células com uma área efetiva de 4,2 centímetros quadrados, que é colocado no topo do poço de DRG dissociado.

Quatro horas após o macrófago do neurônio ter sido co-cultivado, adicione 2 microlitros de solução de AMP 100 micromolares db-cíclico às co-culturas de neurônios macrófagos. Após 24 horas, encha um poço vazio com 1 mililitro de meio de cultura de macrófagos na mesma placa de 6 poços.

Transfira a inserção da cultura celular na co-cultura de neurônios macrófagos para o poço vazio com meio de cultura de macrófagos.