Isolando e cultivando neurônios embrionários de pintinhos em uma matriz de vários eletrodos

Pegue um ovo de galinha fertilizado contendo um embrião em estágio inicial.

Esterilize a casca e abra-a com cuidado.

Remova o embrião. Dissecar e transferir a cabeça para uma placa de cultura contendo um tampão. Remova o globo ocular.

Faça uma incisão e remova as camadas da pele, expondo o prosencéfalo e o mesencéfalo.

Remova a camada membranosa interna e os vasos sanguíneos. Disseque e transfira o prosencéfalo para uma placa de cultura com um tampão.

Corte o tecido em fragmentos menores e transfira-os para um tubo cônico. Depois que os fragmentos se acomodarem, remova o buffer.

Adicione uma solução enzimática proteolítica. Incubar para digerir a matriz extracelular do tecido e soltar os neurônios.

Remova os meios ricos em enzimas, lave com meios neurobasais, removendo quaisquer enzimas restantes.

Adicione meios neurobasais. Dissocie mecanicamente o tecido para obter uma suspensão neuronal.

Semeie esses neurônios em um sistema de matriz de vários eletrodos revestido com uma matriz extracelular. Adicione meios neurobasais e incube.

Os neurônios se ligam e estendem as projeções, formando uma rede neuronal.

No dia do revestimento dos neurônios, remova um frasco de matriz extracelular do freezer de -20 graus Celsius. Pulverize com etanol 70% e coloque no gelo. Certifique-se de descongelar a matriz extracelular no gelo. Não descongele em temperatura ambiente, pois o ECM polimeriza acima de 0 graus Celsius.

Trabalhe no capô BSL-2 para diluir a matriz extracelular a 25%, adicionando 300 microlitros de meio neurobasal frio à alíquota de 100 microlitros. Em seguida, use uma pipeta P200 para adicionar 100 microlitros de solução de matriz extracelular a 25% ao centro da matriz de multieletrodos, tomando cuidado para não tocar nos eletrodos. Remova imediatamente o ECM, deixando uma película fina na superfície.

Cubra a matriz de multieletrodos e coloque na incubadora de cultura de tecidos até que esteja pronto para colocar os neurônios na placa. Comece o isolamento do neurônio do pintinho esterilizando a casca externa de um ovo E7 com 70% de etanol. É importante manter condições estéreis a partir deste ponto. Certifique-se de que todos os instrumentos sejam esterilizados com etanol a 70% e que as soluções sejam estéreis. É útil usar um capuz de dissecação, mas não é absolutamente necessário para dissecações, se for realizado rapidamente.

Então, depois de recuperar e decapitar o embrião, corte ao redor dos olhos e remova os globos oculares. Em seguida, use uma pinça fina Dumont número 5 e uma tesoura de mola para fazer uma incisão no lado ventral e remova as camadas externas da pele para expor o prosencéfalo e o tectum óptico. Descasque e remova a membrana de casca com cuidado.

Transfira o prosencéfalo para outra placa de Petri contendo HBS e corte-o em pequenos pedaços de cerca de 2 milímetros com uma tesoura de mola. Use uma pipeta de transferência estéril para transferir os pedaços de prosencéfalo para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Depois que os pedaços de prosencéfalo afundarem no fundo do tubo da centrífuga, remova o máximo de HBS possível.

Em seguida, adicione 1 mililitro de tripsina-EDTA a 0,5% pré-aquecido e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Use uma pipeta Pasteur para remover cuidadosamente a tripsina sem perturbar os pedaços de tecido. Adicione 1 mililitro de meio neurobasal e deixe os pedaços de tecido afundarem. Depois de remover o meio e repetir a lavagem, adicione 2 mililitros de meio neurobasal e triture suavemente até que não sejam vistos mais pedaços de tecido.

Dilua as células ressuspensas de 1 a 10 com meio neurobasal e conte as células viáveis usando corante azul de tripano e um hemocitômetro. Após a contagem, coloque as células associadas em matrizes de multieletrodos revestidas com ECM a uma densidade de 2.200 células por milímetro quadrado.