Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:53 min. • April 28th, 2025
Pegue uma seção de cérebro de camundongo fixada em tetróxido de ósmio embutida em um bloco de resina.
Obtenha uma imagem de seção e alinhe-a com uma imagem de atlas pré-preparada para identificar a região de interesse.
Marque as bordas desta região no bloco.
Aqueça a resina para amolecê-la e retire a região marcada.
Cole a amostra em uma barra de suporte de vidro e corte-a.
Usando um ultramicrótomo, prepare seções semifinas e ultrafinas.
Transfira as seções semifinas e ultrafinas para suportes de vidro e grades de níquel, respectivamente.
Manchar as seções semifinas com um corante que se liga aos ácidos nucléicos, citoplasma rico em ribossomos e à matriz extracelular.
Lave as seções e examine-as sob um microscópio óptico para confirmar a presença da área-alvo.
Observe as seções ultrafinas sob um microscópio eletrônico de transmissão.
O tetróxido de ósmio aumenta a densidade eletrônica das membranas celulares e de organelas, proporcionando alto contraste contra o citoplasma menos denso em elétrons, permitindo a visualização da ultraestrutura celular.
Para mapear uma área de interesse, selecione uma imagem que contenha a área de interesse do atlas de imagens preparado anteriormente. Esboce as bordas da área de interesse na imagem seccionada. Sobreponha opticamente essas bordas na amostra embutida sob o microscópio e use uma agulha de calibre 26 de uma polegada para riscar essas bordas da região na amostra de resina. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius para amolecer a resina.
Em seguida, retire as amostras de resina quente do forno e use uma lâmina de barbear para extirpar as áreas de interesse. Cole as amostras em barras de suporte de vidro acrílico do calibre apropriado e apare as amostras montadas para seccionamento semifino e ultrafino. Use um ultramicrótomo para adquirir seções semifinas de 0,7 micrômetro e ultrafinas de 70 nanômetros, coletando as seções semifinas em suportes de vidro e as seções ultrafinas em grades de níquel.
Manchar as seções semifinas com azul de toluidina a 1% em PBS por quatro minutos, seguido por várias lavagens em água deionizada antes de examinar as seções por microscopia de luz. As seções ultrafinas podem então ser avaliadas diretamente por microscopia eletrônica de transmissão a 180 quilovolts, sem modificações adicionais.