Analisando estruturas amilóides em uma seção de tecido usando microscopia de imagem de fluorescência

Pegue uma seção de tecido com agregados amilóides representando depósitos anormais de proteínas.

O tecido é corado com o corante fluorescente heptamer-formyl thiophene acético acid ou hFTAA, que se liga especificamente às estruturas de folha beta das fibrilas amilóides.

Imagem da lâmina usando um microscópio confocal equipado com uma unidade de microscopia de imagem de fluorescência, que mede a vida útil de fluorescência das moléculas de corante.

Otimize as configurações do microscópio para excitação eficaz das moléculas de corante.

Quando a luz do laser ilumina o tecido, o hFTAA excita e fluoresce.

A ligação de corante mais forte em estruturas compactas resulta em vida útil mais longa, enquanto a ligação de corante mais fraca em estruturas menos compactas leva a uma vida útil mais curta.

Posteriormente, o software gera uma imagem codificada por cores do agregado.

Cores, como vermelho e amarelo, aparecem na periferia, indicando tempos de vida de fluorescência mais curtos que refletem estruturas amilóides menos compactas e instáveis.

Enquanto cores como azul e verde no núcleo representam tempos de vida de fluorescência mais longos, refletindo estruturas amilóides mais compactas e estáveis.

No dia da coloração, mergulhe as seções em banhos consecutivos de etanol a 99%, etanol a 70%, dH_2O e PBS por 10 minutos de cada vez e, em seguida, deixe as seções de tecido secarem em condições ambientais. Enquanto o tecido seca, prepare uma solução de trabalho de HFTAA diluindo o estoque de 1 a 10.000 em PBS. Quando o tecido estiver seco, adicione gotículas da solução de trabalho HFTAA a cada seção de tecido para cobri-la. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente.

Enxágue a solução de coloração com 500 microlitros de PBS e, em seguida, mergulhe a lâmina no banho de PBS por 10 minutos. Depois de deixar a seção secar em condições ambientais, monte usando meio de montagem de fluorescência. Deixe o meio de montagem assentar durante a noite.

A detecção de amilóide pode ser realizada diretamente após a montagem ou mesmo sem montagem. No entanto, se o objetivo do experimento for coletar informações espectrais de alta qualidade, a incubação noturna é preferida.

Mude o microscópio para o modo FLIM, defina o orifício para 20, o comprimento de onda de excitação para 490 nanômetros e a intensidade do laser para 0,5%. Use lasers pulsados a 40 megahertz. No software FLIM, configure a contagem de fótons acima de 550 nanômetros. Na janela Parâmetros de exibição, siga a contagem de fótons até que a contagem máxima esteja em torno de 4.000 contagens de fótons. Salve o arquivo e exporte-o como imagem SPC.